徐慶雷，朱寶林，馬小波，張　巍，劉玲玲，王勝軍

(沭陽縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇沭陽 223600)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可累及多器官、多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，受累人群常為青年女性，其免疫學(xué)特征為患者血清中出現(xiàn)多種自身抗體和自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞數(shù)量增高[1]。輔助T(helper T，Th)細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)是近年來新命名的一類輔助性CD4+T細(xì)胞亞群，其具有獨(dú)特的分化途徑和轉(zhuǎn)錄因子——孤兒核受體γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)，且以分泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)17為特征[2]。研究表明，Th17細(xì)胞在SLE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3- 4]。鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4(Kruppel-like transcription factor 4，KLF4)是Th17細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)因子[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)(約20～22個(gè)核苷酸)為非編碼RNA，可介導(dǎo)RNA干擾和在翻譯水平抑制蛋白表達(dá)，人類KLF4是miRNA-206的靶分子之一[6]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA-206和KLF4 及RORγt mRNA表達(dá)水平，并分析其與KLF4、RORγt mRNA表達(dá)的相關(guān)性，探討miRNA-206在SLE發(fā)病中的作用機(jī)制。

資料和方法

研究對(duì)象和分組

選擇2012年12月至2013年11月在沭陽縣人民醫(yī)院確診的SLE患者，入選病例均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)1997年修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除伴有心力衰竭、呼吸衰竭、嚴(yán)重肝腎功能損害、嚴(yán)重感染、腫瘤及其他自身免疫病等情況。病情活動(dòng)性評(píng)估采用SLE病情活動(dòng)評(píng)分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)，即2000評(píng)分法[8]。 SLEDAI≤9分納入SLE非活動(dòng)組，SLEDAI>9分納入SLE活動(dòng)組。健康對(duì)照組選擇沭陽縣人民醫(yī)院體檢中心健康體檢志愿者，且均無近期感染或自身免疫病史。

儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR儀為CFX 96型，F(xiàn)icoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)柹镏破酚邢薰?，淋巴?xì)胞刺激劑佛波酯(PMA)、離子霉素購自Sigma公司，PCR引物由上海生工合成，Trizaol和SYBR Green購自Invitrogen公司。

方法

標(biāo)本采集和處理：抽取清晨空腹肘靜脈血3～5 ml，肝素鈉抗凝，隨后用Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液梯度離心得到PBMC，PBS液洗2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于含有淋巴細(xì)胞刺激劑佛波酯(50 ng/ml)和離子霉素(1.0 μg/ml)RPMI 1640完全培養(yǎng)基中37℃、5%CO2飽和濕度條件下溫育5 h后收集細(xì)胞。

KLF4和RORγt mRNA及miRNA-206相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：采用上述方法將PBMC刺激5 h后收集細(xì)胞提取總mRNA。按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄DNA，合成的cDNA存于-20℃冰箱備用。所用引物序列依次為KLF4上游引物5’-CAA GTC CCG CCGCTC CAT TAC CAA-3’，下游引物5’-CCA CAG CCG TCCCAG TCA CAG TGG-3’；RORγt上游引物5’-CCTGGGCTCCTCG CCTGACC-3’，下游引物5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCT TGCC-3’；β-actin上游引物5’-CACGA AACTACCTT CAACTCC-3’，下游引物為5’-CATACTCCTGCT TGCTGATC-3’。以β-actin為參照校準(zhǔn)。miRNA-206上游引物為5’-GAGTGCTGGAATGTAAGGAAG-3’，下游引物為5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，以U6小核RNA(small nuclear-RNA，snRNA)為內(nèi)參照。每份樣本采用相同反應(yīng)體系及條件同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一般資料

共納入SLE患者27例，其中男5例，女22例，平均年齡為(38±11)歲。SLE非活動(dòng)組12例，SLE活動(dòng)組15例。健康對(duì)照組20例，其中男4例，女16例，平均年齡為(35±8)歲。各組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

KLF4和RORγtmRNA及miRNA-206表達(dá)水平比較

SLE患者PBMC中KLF4和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，而miRNA-206相對(duì)表達(dá)量顯著低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

SLE活動(dòng)組PBMC中KLF4和RORγt mRNA表達(dá)水平顯著高于SLE非活動(dòng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，而miRNA-206相對(duì)表達(dá)量顯著低于非活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表1兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞中鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4和孤兒核受體γt mRNA及微小RNA-206表達(dá)水平比較

組別鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4mRNA孤兒核受體γtmRNA微小RNA?206健康對(duì)照組0 104±0 0280 065±0 0140 143±0 059SLE0 637±0 1860 575±0 2630 066±0 021t值6 6737 3863 136P值<0 01<0 01<0 01

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡

表2兩組系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4和孤兒核受體γt mRNA及微小RNA-206表達(dá)水平比較

組別鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4mRNA孤兒核受體γtmRNA微小RNA?206非活動(dòng)SLE組0 131±0 0560 094±0 0190 125±0 038活動(dòng)SLE組0 973±0 2310 968±0 3160 034±0 015t值8 5039 1863 896P值<0 01<0 01<0 01

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡

相關(guān)性分析

SLE患者PBMC中KLF4和RORγt mRNA與SLEDAI呈正相關(guān)(P<0.01)，而miR-206與SLEDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表3)。

直線相關(guān)分析顯示，KLF4和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.684，P<0.01)(圖1)。

直線相關(guān)分析顯示，miRNA-206與KLF4和RORγt mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.627，P<0.01；r=-0.853，P<0.01)(圖2、3)。

討　　論

SLE發(fā)病的確切機(jī)制尚不明了，研究證實(shí)T細(xì)胞免疫異常起著非常重要的作用，且與疾病發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有很大關(guān)系。Th17細(xì)胞是一類不同于Th1和Th2的CD4+T細(xì)胞新亞群，此類細(xì)胞以主要分泌IL-17得名。RORγt是Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控IL-17的分泌[2]。研究表明，Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[3- 4]。Wong等[9]報(bào)道，SLE患者外周血Th17細(xì)胞顯著升高，且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA的表達(dá)顯著增高，與SLEDAI呈顯著正相關(guān)(r=0.719，P<0.01)，說明RORγt mRNA升高與SLE的發(fā)生及活動(dòng)性密切相關(guān)。另外，本研究將SLE患者按疾病活動(dòng)度分為活動(dòng)組與非活動(dòng)組后比較發(fā)現(xiàn)，SLE活動(dòng)組RORγt mRNA顯著高于SLE非活動(dòng)組和健康對(duì)照組，而SLE非活動(dòng)組與健康對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RORγt mRNA水平高低可反映SLE疾病的活動(dòng)性。

表3　系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4和孤兒核受體γt mRNA及微小RNA-206表達(dá)水平與病情活動(dòng)評(píng)分相關(guān)性分析

圖1系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4和孤兒核受體γt mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

Fig1Correlation analysis between the expression levels of Kruppel-like factor 4 and orphan nuclear receptor γt in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

圖2系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中微小RNA-206與鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子4 mRNA相關(guān)性分析

Fig2Correlation analysis between the expression levels of Kruppel-like factor 4 and microRNA-206 in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

圖3系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中微小RNA-206與孤兒核受體γt mRNA相關(guān)性分析

Fig3Correlation analysis between orphan nuclear receptor γt and microRNA-206 in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

KLF家族是真核生物中一大類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basic transcription element-binding protein，BTEB)[10]，KLF4則為其家族中的一員。KLF4包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即高度保守的C-端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，高度可變的N-端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和核定位序列[11]。KLF4能結(jié)合靶基因富含Gc的啟動(dòng)子序列，促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)；且對(duì)Th17細(xì)胞分化具有正調(diào)節(jié)作用[5]。本研究結(jié)果示，SLE患者PBMC中KLF4 mRNA表達(dá)顯著增高，且與RORγt mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.684，P<0.01)；提示SLE患者PBMC中KLF4 mRNA可以上調(diào)RORγt mRNA表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。此外，本研究將SLE患者按疾病活動(dòng)進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，SLE活動(dòng)組KLF4 mRNA顯著高于SLE非活動(dòng)組與健康對(duì)照組，與上述SLE活動(dòng)組RORγt mRNA顯著高于SLE非活動(dòng)組與健康對(duì)照組結(jié)果一致，驗(yàn)證了KLF4 mRNA是調(diào)控Th17細(xì)胞重要因子的結(jié)論。

miRNA是一類內(nèi)源性小分子RNA，其常規(guī)作用方式是通過與靶基因的3’UTR結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)[12]。人類KLF4是miRNA-206的靶分子之一，miRNA-206對(duì)KLF4的表達(dá)具有抑制作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC中miRNA-206表達(dá)下降而KLF4 mRNA表達(dá)水平升高，兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.627，P<0.01)，與其結(jié)果相符；SLE活動(dòng)組miRNA-206顯著低于SLE非活動(dòng)組與健康對(duì)照組，miRNA-206與SLEDMI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.654，P<0.01)，證實(shí)了活動(dòng)期SLE患者體內(nèi)miRNA-206減少。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC中miRNA-206與RORγt mRNA表達(dá)也呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.853，P<0.01)，提示miRNA-206可能通過調(diào)節(jié)KLF4 mRNA的表達(dá)，參與調(diào)控Th17細(xì)胞。

SLE是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PBMC中miRNA-206、KLF4和RORγt mRNA表達(dá)存在顯著異常，并與疾病活動(dòng)性密切相關(guān)，提示這三者共同變化可能在SLE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，由此為SLE發(fā)病機(jī)制和治療學(xué)的研究提供新思路。然而，其相關(guān)分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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