閆秀梅，閆景彬，黃愛(ài)芬，黃開宇

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，溫州 325000)

食物過(guò)敏在全球的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響兒童生活質(zhì)量[1]。研究表明，兒童食物過(guò)敏發(fā)病率為4%～6%。流行病學(xué)資料顯示，從2003到2013年18歲以下兒童食物過(guò)敏發(fā)生率增加了18%[2]。然而，目前尚無(wú)食物過(guò)敏的特效療法。由于倫理學(xué)限制和嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)，使人類食物過(guò)敏的研究受到限制。所以，利用食物過(guò)敏原建立動(dòng)物食物過(guò)敏模型尋求新的預(yù)防和治療措施是最為常用的研究方法。目前，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的食物過(guò)敏動(dòng)物模型建立方法，本研究探討SD大鼠食物過(guò)敏動(dòng)物模型的適宜條件及該模型消化系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的改變，探索理想的動(dòng)物模型，以期為食物過(guò)敏的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4周齡斷乳SD幼鼠30只，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心以不含卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的標(biāo)準(zhǔn)飼料及滅菌雙蒸水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度23℃±3℃，濕度50%～70%，體質(zhì)量60～80 g。鼠籠每周清洗消毒2次，采用12 h：12 h自動(dòng)晝夜循環(huán)。

分組及模型建立

將30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱量并記錄各自體重，隨機(jī)編取30個(gè)數(shù)字，取其中20只為食物過(guò)敏組，10只為對(duì)照組。食物過(guò)敏組：第1天以含OVA 40 μg和氫氧化鋁31 mg的無(wú)菌生理鹽水0.5 ml溶液腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏；第15天腹腔注射含OVA 40 μg的無(wú)菌生理鹽水0.5 ml進(jìn)行強(qiáng)化致敏；第20天起以O(shè)VA生理鹽水溶液0.5 ml(OVA含量為30 mg)行隔日灌胃激發(fā)直至第49天。對(duì)照組：等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射及灌胃。以腹瀉為造模成功標(biāo)志。

血清OVA-IgE檢測(cè)

腹腔注射第1天記為第0天，分別于1、2、3、4、5、6、7周從大鼠尾靜脈取血1次，每次約0.5 ml，將其室溫靜置30 min后離心，獲得血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清OVA-IgE抗體水平。具體步驟參照說(shuō)明書。

腸組織病理學(xué)檢測(cè)及超微結(jié)構(gòu)觀察

實(shí)驗(yàn)第49天麻醉大鼠，取其十二指腸Treitz韌帶以下5 cm小腸標(biāo)本，一段放于中性甲醛固定液中并以石蠟包埋和切片，一塊(1 mm×1 mm×1 mm)放于電鏡液中(溫州醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供)以進(jìn)行光鏡與電鏡標(biāo)本組織形態(tài)學(xué)觀察。隨機(jī)連續(xù)計(jì)數(shù)每個(gè)腸組織玻片高倍視野內(nèi)腸黏膜嗜酸粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)數(shù)目，累計(jì)10個(gè)高倍視野內(nèi)EOS總數(shù)，取平均值作為EOS密度。甲苯胺藍(lán)特殊染色后進(jìn)行肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)連續(xù)計(jì)數(shù)每個(gè)腸組織玻片10個(gè)高倍視野內(nèi)MC數(shù)，取平均值代表其密度(個(gè)/HPF)；累計(jì)10個(gè)高倍視野內(nèi)MC總數(shù)及脫顆粒MC數(shù)，計(jì)算MC完整性百分率，公式為MC完整性百分率=[(肥大細(xì)胞總數(shù)-脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù))/肥大細(xì)胞總數(shù)]×100%。電鏡下觀察小腸黏膜層絨毛、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及緊密連接改變。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析方法分析抗體含量組間差別、時(shí)間變化趨勢(shì)及組別和時(shí)間的交互作用。采用多元方差分析方法分析不同時(shí)間點(diǎn)組間差異。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一般情況

食物過(guò)敏組表現(xiàn)為狂躁不安、易激惹。灌胃30 min后觀察大鼠腹瀉情況，20%食物過(guò)敏組動(dòng)物在灌胃激發(fā)后3次出現(xiàn)腹瀉，40%在第4次出現(xiàn)腹瀉，>90%在第7次發(fā)生腹瀉，第10次所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉。

血清OVA-sIgE檢測(cè)結(jié)果

食物過(guò)敏組OVA-IgE水平在第4～6逐漸升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。食物過(guò)敏組OVA-IgE水平在第7周下降，與對(duì)照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

腸黏膜EOS密度比較和組織形態(tài)學(xué)改變

與對(duì)照組(n=5)相比，食物過(guò)敏組(n=10)腸黏膜EOS密度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.70±0.42)個(gè)/HPFvs. (16.48±2.32)個(gè)/HPF，P=0.001]。光鏡下可見(jiàn)食物過(guò)敏組動(dòng)物腸黏膜明顯損傷，小腸絨毛破壞、腫脹、脫落且明顯減少。對(duì)照組腸黏膜形態(tài)完整，腸絨毛排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰完整(圖1)。

腸黏膜組織肥大細(xì)胞密度和完整性百分率

對(duì)照組腸黏膜固有層僅能看到極少量肥大細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，無(wú)聚集、脫顆?，F(xiàn)象；食物過(guò)敏組腸黏膜固有層可見(jiàn)較多肥大細(xì)胞聚集，伴胞膜破裂，輪廓不清，并向外排出紫紅色顆粒(圖2)。

食物過(guò)敏組(n=10)和對(duì)照組(n=5)腸黏膜肥大細(xì)胞總數(shù)分別為(9.02±1.55)個(gè)/HPF和(1.84±0.87)個(gè)/HPF，完整性百分率分別為(36.50%±12.54%)和(92.20%±6.87%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

腸黏膜層電鏡超微結(jié)構(gòu)改變

與對(duì)照組相比，食物過(guò)敏組電鏡下腸黏膜層小腸絨毛排列紊亂，甚至脫落，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，細(xì)胞連接增寬(圖2)。

討　　論

目前，國(guó)內(nèi)外已發(fā)表較多關(guān)于OVA致食物過(guò)敏動(dòng)物模型的報(bào)道，但建模所選取的動(dòng)物種類不一，建模方式也各有不同，建模標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。模型較多采用小鼠致敏模型[3- 4]，包括C3H/HeJ、BALB/c、C57/BL6和DBA/2小鼠等，主要是因?yàn)轶w積小，繁殖周期短，容易處理，通常不受遺傳基因影響；且易產(chǎn)生高IgE和高IgG可用作研究食物過(guò)敏；然而，連續(xù)間斷性收集血液標(biāo)本則較難達(dá)到。也有學(xué)者采用BN大鼠建立食物過(guò)敏動(dòng)物模型[5]，BN大鼠食物過(guò)敏模型的優(yōu)點(diǎn)是動(dòng)物大小適中，易連續(xù)采血觀察血清特異性IgE和IgG。de Jonge等[6]分別給不同品系鼠口服雞OVA6周，結(jié)果只有BN鼠能產(chǎn)生高水平的OVA特異性IgE抗體。但也有研究表明，BN鼠在新生期經(jīng)口腔給予OVA，斷乳后再灌胃或腹腔注射OVA均不能誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)[7]。所以，為增加BN鼠口服致敏的敏感性和避免交叉反應(yīng)，需要至少連續(xù)兩代用不含所研究蛋白或同種其他蛋白的特制飼料喂養(yǎng)。本研究選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，SD大鼠屬于遠(yuǎn)交系封閉群，生長(zhǎng)快，繁殖周期短，抗病力強(qiáng)，容易飼養(yǎng)，價(jià)格較BN鼠便宜。與BALB/c小鼠相比，SD大鼠可間斷收集血液標(biāo)本，是我國(guó)比較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用SD大鼠建立食物過(guò)敏動(dòng)物模型，其所有大鼠均發(fā)生腹瀉，IgE明顯升高，小腸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表明可應(yīng)用SD大鼠建立食物過(guò)敏模型。

表1　兩組SD大鼠不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間血清卵清蛋白-IgE含量變化

與對(duì)照組比較，*P<0.01

誘導(dǎo)食物過(guò)敏有多種途徑，包括口服給藥、腹腔注射、灌胃給藥和皮下注射等。不同鼠類種系致敏途徑不同。有研究應(yīng)用BALB/c小鼠研究不同給藥途徑致敏情況，5周齡雄性BALB/c小鼠第1天腹腔注射OVA(50 μg)，2周后再次腹腔注射OVA(50 μg)，同時(shí)應(yīng)用氫氧化鋁為佐劑，2周后每隔1 d灌胃口服OVA(50 mg)，小鼠腹瀉持續(xù)1 h，連續(xù)6個(gè)月，而為進(jìn)行腹腔注射的小鼠未發(fā)生腹瀉；該研究者認(rèn)為，可能與未經(jīng)過(guò)腹腔注射致敏小鼠容易發(fā)生口服耐受有關(guān)[8]。也有研究表明，佐劑如氫氧化鋁等預(yù)處理可預(yù)防口服耐受。Golias等[9]研究了2個(gè)月齡雌性BALB/c小鼠，分別于第1和14天腹腔注射OVA 60 μg和1 mg氫氧化鋁，2周后每2～3 d灌胃1次15 mg OVA，共10次，灌胃30 min后觀察腹瀉情況；第5次灌胃后70%小鼠發(fā)生腹瀉，第7次超過(guò)90%小鼠發(fā)生腹瀉，第10次100%發(fā)生腹瀉，本研究結(jié)果與之相似。本研究為造模成功，同樣使用氫氧化鋁佐劑與腹腔注射基礎(chǔ)致敏，結(jié)果示所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉，提示低劑量基礎(chǔ)致敏(加佐劑)與高劑量灌胃激發(fā)可成功造模。

Chen等[10]研究了劑量、致敏時(shí)間與IgE的相關(guān)性，分別給予6～8周齡BALB/c小鼠腹腔注射5、0.05、0.5 mg OVA，致敏次數(shù)分別為2次(第0和3天)和5次(第0、3、6、9和12天)，并檢測(cè)IgE水平；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射0.05 mg OVA，激發(fā)5次會(huì)產(chǎn)生較高水平IgE且更易致敏，第28天IgE水平較高。Atkinson和Miller[11]給予BN大鼠口服OVA 0.5～6.25 mg/100 g，2次/周，持續(xù)6周；第21天給予OVA 2.5 mg/100 g后BN大鼠均出現(xiàn)IgG升高，且該水平在第28天達(dá)到高峰；高劑量組(5 mg/100 g～6.25 mg/100 g)IgE水平在第14天即可測(cè)出，而低劑量組在第28天才可測(cè)出。Kostadinova等[12]通過(guò)BN大鼠研究了食物過(guò)敏模型，該研究規(guī)定了OVA劑量(0.002～20 mg/ml)、激發(fā)途徑(口服或灌胃)和激發(fā)次數(shù)(每天，2次/周，1次/周，每2周1次)等3個(gè)主要條件，持續(xù)6周；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每天灌胃1 mg OVA，在第28和42天可檢測(cè)特異性IgE，口服0.002、0.02和0.2 mg OVA均未產(chǎn)生特異性抗體；口服2 mg和20 mg OVA可產(chǎn)生IgG抗體，但未產(chǎn)生IgE抗體；該實(shí)驗(yàn)表明，給藥途徑和劑量均可影響免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)外文獻(xiàn)[8]，致敏時(shí)間至49 d，首先腹腔注射基礎(chǔ)致敏及強(qiáng)化致敏，同時(shí)應(yīng)用佐劑，然后大劑量隔日灌胃激發(fā)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有大鼠均出現(xiàn)腹瀉，且EOS和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高，小腸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。

食物過(guò)敏模型的研究已取得了很大進(jìn)展，但是國(guó)際上仍未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)模型。本研究采用致敏原OVA與免疫佐劑氫氧化鋁，通過(guò)低劑量OVA腹腔注射致敏聯(lián)合高劑量OVA灌胃激發(fā)成功建立了SD大鼠食物過(guò)敏模型。

(本文圖1、2見(jiàn)封三)

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