吳源旻, 徐源俊, 王善金, 譚　軍

(同濟(jì)大學(xué) 東方醫(yī)院,上海 200120)

缺氧對(duì)體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞骨鈣素水平的影響

吳源旻, 徐源俊, 王善金, 譚軍

(同濟(jì)大學(xué) 東方醫(yī)院,上海 200120)

摘要:研究了缺氧對(duì)體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞骨鈣素表達(dá)的影響及意義.將人髓核細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng),在顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài);在傳代培養(yǎng) 24、48、72 h時(shí)分別收集2組細(xì)胞,采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)骨鈣素的表達(dá),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行了半定量檢測(cè),光密度值顯示:體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞在 48、72 h時(shí),缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平均明顯高于常氧組(平均光密度值分別為180.50±8.76 vs 169.29±3.04、190.87±7.06 vs 166.33±4.44,均P<0.01),且缺氧組髓核細(xì)胞骨鈣素表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高.常氧組各時(shí)間段之間髓核細(xì)胞骨鈣素表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.缺氧可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞骨鈣素的表達(dá)上調(diào),缺氧環(huán)境下髓核細(xì)胞的骨鈣素過(guò)表達(dá),缺氧可能對(duì)椎間盤軟骨終板礦化起到促進(jìn)作用.

關(guān)鍵詞:髓核細(xì)胞; 骨鈣素; 缺氧; 免疫組化

椎間盤由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板3 部分組成,是人體中最大的無(wú)血管組織.四歲時(shí)椎間盤就幾乎沒有任何血管,間盤營(yíng)養(yǎng)嚴(yán)重減少,髓核細(xì)胞群隨之發(fā)生明顯變化,脊索細(xì)胞被更多的能適應(yīng)無(wú)氧環(huán)境的軟骨細(xì)胞和纖維母細(xì)胞所代替;十歲時(shí)頸椎間盤已經(jīng)成為一個(gè)無(wú)血管的組織,其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要來(lái)自于軟骨終板的滲透.軟骨終板中央部分滲透性較周圍部分高.軟骨終板中央部分有1/3區(qū)域可以滲透,而周圍部分僅約1/10 區(qū)域可以滲透;軟骨終板在髓核處溶質(zhì)滲透占整個(gè)軟骨終板的85%,在軟骨終板接近內(nèi)呈纖維環(huán)處下降到35%,在軟骨終板接近外層纖維環(huán)界面處幾乎完全不能滲透.椎間盤營(yíng)養(yǎng)通路主要有終板途徑和纖維環(huán)途徑:椎體內(nèi)的血管不斷分支,在軟骨終板下骨質(zhì)形成血管袢,包括氧氣在內(nèi)的絕大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)這些血管袢經(jīng)擴(kuò)散作用透過(guò)軟骨終板、椎間盤基質(zhì),最終到達(dá)內(nèi)部的椎間盤細(xì)胞,而乳酸等代謝廢物經(jīng)過(guò)相反途徑排出,此即終板途徑,Du 等通過(guò)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI 清楚觀察到這一現(xiàn)象[1];小部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)分布到最外層纖維環(huán)的血管末梢來(lái)提供養(yǎng)分,即纖維環(huán)途徑[2-3].但隨著機(jī)體的老化,供應(yīng)椎間盤周圍的血管數(shù)量減少,軟骨終板逐漸鈣化,氧氣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)及代謝廢物的排除受到阻滯,椎間盤內(nèi)逐漸形成缺氧微環(huán)境.這種微環(huán)境對(duì)椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展如何產(chǎn)生影響,椎間盤退變是否與缺氧環(huán)境有關(guān),這些都成為近年來(lái)學(xué)者們研究的重要課題.骨鈣素是骨轉(zhuǎn)化的重要指標(biāo),能反應(yīng)骨質(zhì)疏松的狀況[4].最近研究發(fā)現(xiàn)骨鈣素參與誘導(dǎo)椎間盤軟骨終板的退變鈣化過(guò)程,影響椎間盤退變[5].本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞,應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理,對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究,判斷缺氧環(huán)境是否是骨鈣素(OCN)變化的因素.

1材料與方法

1.1　主要試劑和儀器

永生化人髓核細(xì)胞株(上海拜力生物),基礎(chǔ)培養(yǎng)箱,HF100三氣培養(yǎng)箱,骨鈣素(OCN)檢測(cè)試劑盒(一抗,二抗,中杉金橋公司),磷酸鹽緩沖液(PBS),4%多聚甲醛試劑,曲拉通X-100,H2O2溶液,牛血清白蛋白(BSA),DAB顯色試劑盒,CKX31-A12PHP 倒置顯微鏡(Olympus 公司).

1.2　免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)髓核細(xì)胞常氧與需氧下OCN表達(dá),采用免疫組織化學(xué)SABC法

制作髓核細(xì)胞爬片,于37℃常氧培養(yǎng)箱,和模仿椎間盤缺氧(3% O2)條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);于規(guī)定時(shí)間節(jié)點(diǎn)取出細(xì)胞爬片,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min,室溫干燥;4%多聚甲醛固定20 min,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;3%Triton-100處理20 min,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;3%H2O2處理15 min,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;山羊血清或者BSA封閉2 h,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;一抗(兔抗人 OCN單抗(1∶200))4℃過(guò)夜封閉; 將玻片從4℃取出,室溫復(fù)溫30 min,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;室溫孵育二抗(生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體),結(jié)合2 h,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;三抗(SABC)封閉,室溫下結(jié)合2 h,PBS緩慢洗滌3次,每次5 min;DAB顯色3~10 min,待細(xì)胞出現(xiàn)特異性染色后用水洗滌,鏡檢;鹽酸乙醇分化,氨水反藍(lán),鏡檢;脫水,封閉;拍攝,細(xì)胞核均染為藍(lán)色,OCN表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)均染為棕色.

1.3　免疫組化圖像分析

用Image-Pro Plus(IPP)6.0 分析免疫組化圖片,根據(jù)染色染料顏色的深淺(光密度)及分布面積大小來(lái)確定目標(biāo)蛋白的量.染色區(qū)域分布面積與目標(biāo)蛋白量成正比.染色的顏色深淺(光密度)與目標(biāo)蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律,是對(duì)數(shù)關(guān)系.每張切片在高倍鏡下(×100)隨機(jī)選取8 個(gè)視野,應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量檢測(cè),結(jié)果以平均灰度值表示.平均灰度值高(染色強(qiáng)度弱、透光度強(qiáng))表示OCN表達(dá)水平低;反之則表示表達(dá)水平高.平均光密度OD值(吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度,與染色物質(zhì)的量相關(guān))高,表示OCN表達(dá)水平高;反之則表示表達(dá)水平低.將圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來(lái),得到IOD.此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比.IOD值除以細(xì)胞個(gè)數(shù),得到單個(gè)細(xì)胞的mean density,此值反映了單個(gè)細(xì)胞OCN表達(dá)的水平.

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.檢測(cè)數(shù)據(jù)以m±s表示,組間比較采用單因素方差分析 Tamhane′s T2檢驗(yàn),以P<0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1　生長(zhǎng)曲線分析

檢測(cè)結(jié)果見圖1~2在培養(yǎng) 48、72 h 時(shí),缺氧組髓核細(xì)胞較常氧組細(xì)胞增殖速度減緩>40%.

2.2　常氧與需氧環(huán)境中髓核細(xì)胞OCN的表達(dá)髓核細(xì)胞OCN的表達(dá)

檢測(cè)結(jié)果見圖3~4和表1.

缺氧組與常氧組均可見OCN表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞,且與常氧組比較,缺氧組多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色較深.在培養(yǎng)24 h時(shí),缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平與常氧組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在培養(yǎng)48、72 h時(shí),缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平均明顯高于常氧組(P<0.01),且缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高(P<0.01),常氧組各時(shí)間段之間髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

3討論

近年來(lái)在椎間盤組織工程及生物學(xué)研究方面取得的進(jìn)展,為椎間盤退行性變的生物學(xué)治療提供了較好前景.大量的研究表明,OCN 參與了椎間盤軟骨終板的退變鈣化過(guò)程,OCN 敲除可能抑制軟骨終板的退變鈣化[6].Idelevich 等研究證實(shí)OCN 過(guò)表達(dá)能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞株的分化及礦化[7],而OCN siRNA 能抑制主動(dòng)脈血管的骨化和礦化[8].

本實(shí)驗(yàn)在體外成功構(gòu)建了人髓核細(xì)胞缺氧模型,通過(guò)免疫組織化學(xué)方法,對(duì)不同缺氧時(shí)期OCN在體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果顯示在培養(yǎng)48、72 h時(shí),缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平均明顯高于常氧組(P<0.01),且缺氧組髓核細(xì)胞OCN表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高,說(shuō)明缺氧可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞OCN的表達(dá)上調(diào),缺氧環(huán)境下髓核細(xì)胞的骨鈣素過(guò)表達(dá),這個(gè)結(jié)果也可以間接說(shuō)明缺氧可能對(duì)椎間盤軟骨終板礦化起到促進(jìn)作用.

本實(shí)驗(yàn)有助于進(jìn)一步揭示椎間盤退變的病理機(jī)制,為椎間盤退變的防治開辟新思路與新途徑.

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(責(zé)任編輯：顧浩然)

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Study on the effeets of hypoxia on the level ofOCN in nucleus pulposus cellsWU Yuanmin, XU Yuanjun, WANG Shanjin, TAN Jun

(Dongfang Hospital,Tongji University,Shanghai 200120,China)

Abstract:In order to studing the effects of hypoxia on the level of OCN in nucleus pulposus cells.Human nucleus pulposus cell were line cultured in vitro.The growth morphological of nucleus pulposus cells were observed under a microscope.Two groups of cells were collected respectively from 24,48,72 h in culture.Immunohistochemical SABC method was used in the OCN expression.Then IPP image analysis system was used in the semi quantitative detection results of which were expressed by optical density value.Results suggested that expression of hypoxia group of nucleus pulposus cells OCN levels were significantly higher than the normal oxygen group at 48,72 h in vitro.The average optical density values were 180.50+8.76 vs 169.29+3.04,190.87+7.06 vs 166.33+4.44,P<0.01.Hypoxia group of nucleus pulposus cells OCN level increased steadily with hypoxia time(P<0.01).There is no significant difference on between different time groups the expression level of OCN in normal oxygen nucleus pulposus cells OCN between each time group.Hypoxia can induce nucleus pulposus cells overexpress OCN.Hypoxia may contribute to intervertebral disc endplate cartilage mineralization.

Key words:nucleus pulposus cells; hypoxia; OCN; immunohistochemistry

通信作者:譚軍,中國(guó)上海市浦東新區(qū)即墨路150號(hào),同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院脊柱外科,郵編:200120,E-mail:dr.tan@139.com;王善金,中國(guó)上海市浦東新區(qū)即墨路150號(hào),同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院脊柱外科,郵編:200120,E-mail:kingspine@163.com

基金項(xiàng)目:同濟(jì)大學(xué)青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)行動(dòng)計(jì)劃(2013KJ075);國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81201418);浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助

收稿日期:2015-03-01

中圖分類號(hào):Q 253

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1000-5137(2015)02-0154-04