尚永剛，韓廣瑋，董小小，崔 棟，劉城城，易善紅 (.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院泌尿外科，重慶400037;.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲診斷科，重慶400037)

慢性前列腺炎是最常見的前列腺疾?。?］，流行病學調查顯示，約30% ～40% 的中青年男性患有此?。?］。臨床上多以尿路刺激征、會陰部及下腰部疼痛不適等為主要表現(xiàn)［3］，并多伴有焦慮、抑郁等精神癥狀［4］，嚴重危害著患者的身心健康。臨床上有多種方法治療慢性前列腺炎，但效果欠佳，治療后容易復發(fā)［5］。近年來的研究表明，“血－前列腺屏障”的存在是限制慢性前列腺炎治療效果的重要因素［6］，如何開放“血－前列腺屏障”，提高前列腺組織的通透性是近年來研究的熱點。在前期的研究中，我們觀察到微泡介導下低頻超聲輻照可以顯著提高動物前列腺組織的通透性［7］，該方法可能成為治療慢性前列腺炎的一種新方法。但是，超聲微泡作用是否能提高前列腺組織中的藥物濃度，尚未明確。因此，我們通過實驗觀察微泡介導下低頻超聲輻照對前列腺組織中藥物濃度的影響，以尋求治療慢性前列腺炎的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

頭孢呋辛鈉標準品0.5 g(中國藥品生物制品檢定所);注射用頭孢呋辛鈉粉針0.75 mg(意大利EssetiFarmaceuticis.r.l);造影劑微泡(脂氟顯，第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院超聲科自行研制);0.9%氯化鈉注射液500 mL(四川科倫藥業(yè)公司);15%三氯乙酸(成都市科隆化工試劑公司);3%戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗儀器

低功率超聲治療儀(第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院超聲科自行研制);美國Waters 高效液相色譜儀;高速離心機(貝克曼Allegra 64R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 選取200 ～300 mg 的成年雄性SD 大鼠20 只(購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心)，采用抽簽法隨機分為實驗組(超聲微泡+頭孢呋辛組)及對照組(頭孢呋辛組)，每組10 只。

1.3.2 標本收集 在實驗組中，沿下腹部正中切口暴露前列腺后將配置好的頭孢呋辛鈉溶液(60 mg/kg)與造影劑微泡(0.1 mL/kg)經尾靜脈同時注入大鼠體內，隨后立即給予超聲治療儀持續(xù)輻照前列腺5 min(頻率1.0 MHz，聲壓250 kPa，占空比1%，聲壓0.023 W/cm2)。同樣方法暴露對照組大鼠前列腺，經尾靜脈同時注射頭孢呋辛鈉溶液(60 mg/kg)與生理鹽水(0.1 mL/kg)，隨后給予超聲假照5 min(不發(fā)射超聲波)。輻照結束后立即取出前列腺組織，置于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.3 樣品的制備 將前列腺組織置于室溫下避光解凍，用生理鹽水漂洗前列腺，洗凈前列腺組織表面淤血，吸水紙吸干后準確稱取其質量，放置于試管中，剪碎，加入生理鹽水2 mL，制成組織勻漿。漩渦混勻30 s 后置于10 000 r/min 離心機中離心5 min，取上清，加入15%三氯乙酸0.4 mL 沉淀蛋白后再次離心5 min，取上清液0.4 mL 待測。

1.3.4 標準液的制備 精密稱取頭孢呋辛標準品50 mg 置于50 mL 容量瓶中，加入超純水50 mL 定容，即制備成1 mg/mL的標準液。

1.3.5 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:酸鈉緩沖液－ 乙腈(75 ∶25);pH:3.9;流速:1 mL/min;進液量:10 μl;檢測波長:272 nm。

1.3.6 色譜行為 取空白前列腺組織，按1.3.3 中方法制備前列腺組織上清液，取上清液0.4 mL，進樣10 μl，得到空白前列腺組織上清液色譜圖;取1 mg/mL 頭孢呋辛標準液0.4 mL，進樣10 μl，得到頭孢呋辛標準品色譜圖;將1 mg/mL 頭孢呋辛標準液與空白前列腺組織上清液均勻的混合，取10 μl 進樣，得到頭孢呋辛標準及前列腺上清液混合物色譜圖。

1.3.7 標準曲線的繪制 依次將配置好的頭孢呋辛標準液稀釋為0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 及50 μg/mL的溶液，按前列腺樣品液處理方法處理后進樣。記錄各質量濃度下的色譜峰面積，以X 軸為質量濃度，Y 軸為峰面積做圖，即可得到頭孢呋辛標準曲線。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 色譜行為

空白前列腺組織上清液色譜圖、頭孢呋辛標準品色譜圖和頭孢呋辛標準品和前列腺上清液混合物色譜圖見圖1。由圖可見，前列腺組織上清液及頭孢呋辛標準品的保留時間分別約為2.9 min、4.5 min，頭孢呋辛色譜峰與前列腺組織雜質色譜峰完全分離，前列腺組織上清液內雜質對頭孢呋辛樣品定量測定干擾較小。

圖1 頭孢呋辛標準品與空白前列腺的HPLC 色譜圖

2.2 標準曲線

以測得的各質量濃度頭孢呋辛標準液色譜峰面積為縱軸，以標準液質量濃度為橫軸，得到頭孢呋辛標準曲線(圖2)。外標法定量，采用加權最小二乘法進行回歸計算。求得直線回歸方程為:y=33 066x－2 515.9(R2=0.999，n=5)。

圖2 頭孢呋辛標準曲線

2.3 前列腺組織中頭孢呋辛質量濃度測定

以高效液相色譜儀檢測各樣品中頭孢呋辛含量，并根據樣品處理前前列腺質量計算單位質量前列腺組織中所含頭孢呋辛質量濃度。實驗組及對照組單位質量前列腺組織中所含頭孢呋辛質量濃度分別為(16.274 ±9.515)μg/mg、(8.336 ±6.743)μg/mg，與對照組比較，實驗組中單位質量前列腺組織中所含頭孢呋辛質量濃度明顯升高(P ＜0.05)，見表1。

表1 超聲微泡作用后前列腺組織中頭孢呋辛質量濃度比較(μg/mg)

3 討論

血－腦屏障、血－睪屏障目前已經通過許多實驗得到了證實，而在男性泌尿生殖系統(tǒng)中是否也存在著相似的屏障結構呢?Motrich 等［8］通過實驗證實在自身免疫性前列腺炎大鼠中，精子的損害發(fā)生在精子和前列腺液混合過程中，因此，學者們認為在前列腺組織中可能也存在一個與血－腦屏障、血－睪屏障相似的“屏障”結構，并具有阻止炎癥發(fā)生和炎細胞遷移、保護精子免受損害的作用［9］。血－腦屏障限制水溶性以及大分子脂溶性物質進入腦內，起到了維持大腦內環(huán)境穩(wěn)定的作用，但妨礙了大分子藥物進入腦內，使腦部疾病藥物治療較為困難［10］。血－前列腺屏障有可能也存在相似的功能，限制藥物進入前列腺組織。另外，前列腺組織發(fā)生慢性炎癥時，導致前列腺組織發(fā)生病理改變，纖維組織增生、基底膜增厚、細胞間緊密連接更加致密加強等原因，進一步加強了這種“屏障”作用［11］。由此可以推測，進入血液的藥物成分就可能受到血－前列腺屏障的限制而只有少量能到達前列腺組織內發(fā)揮作用，這正好解釋了為什么大多數抗菌藥物在前列腺液中濃度比較低［12］，以至于不能最大限度發(fā)揮藥物療效。因此，如何開放血－前列腺屏障成為近年來實驗研究和臨床治療慢性前列腺炎的熱點話題。

造影劑微泡作為一種新型的聲學造影劑，既可以增強超聲顯像，又可以介導低頻超聲輻照提高局部組織的通透性，使藥物在局部達到較高濃度［13］。其原理主要是在微泡介導下超聲波通過其空化效應，使微血管及細胞生物膜受損，增加血管內皮細胞之間以及生物膜間的空隙，促進血液內成分溢出血管并通過生物膜到達治療部位，總的來說，就是增加了生物屏障的通透性［14］。微泡介導下低頻超聲輻照開放血－腦屏障(或血－腫瘤屏障)并靶向釋放藥物及基因治療神經系統(tǒng)疾病的研究應用較多［15-16］，已經證明有很好的臨床應用價值。

在前期實驗中，本課題組成員觀察到經微泡介導下的低頻超聲輻照能顯著提高滲入到動物前列腺組織中的伊文思藍濃度，提示微泡介導下低頻超聲輻照提高了前列腺組織的通透性，此方法可能成為治療慢性前列腺炎的一種新方法［7］。而本研究更直觀地顯示，微泡介導下低頻超聲輻照顯著提高了動物前列腺組織中的頭孢呋辛濃度，再次證實超聲微泡可以顯著提高前列腺組織通透性的事實，為后期超聲微泡在治療慢性前列腺炎中的應用進一步奠定了理論基礎。

雖然微泡介導下低頻超聲輻照能顯著提高前列腺組織中的藥物濃度，但其具體機制仍不明確。前期研究通過透射電鏡觀察到經超聲微泡作用后前列腺組織中毛細血管內皮細胞間的緊密連接遭到破壞，表明超聲微泡作用可能通過開放緊密連接來提高前列腺組織的通透性［7］，目前關于這方面的研究較少，有進一步研究的價值。

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