王佳寧 , 李曉明 張 鵬 , 徐剛明 王斌貴

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

海洋天然產(chǎn)物是海洋動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物, 是許多新藥制劑或藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。近幾年的研究發(fā)現(xiàn), 許多分離自海藻、海綿、珊瑚等海洋動(dòng)、植物中的天然產(chǎn)物很有可能是由其共生或附生的海洋微生物協(xié)同作用產(chǎn)生的[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的微生物約 150多萬種,其中72 000種存在于陸地, 而海洋微生物僅1 500種,因此仍有大量的海洋微生物資源有待深入研究[2]。隨著對海洋資源的開發(fā)日益深入, 海洋微生物次生代謝產(chǎn)物的研究受到越來越多的關(guān)注。

本文報(bào)道了從煙臺(tái)養(yǎng)馬島采集的日本仙菜(Ceramium japonicum)中分離得到的一株海洋內(nèi)生真菌Aspergillus versicolorEN-298, 并從其發(fā)酵粗提物中分離得到10個(gè)單體化合物。通過一維、二維核磁共振技術(shù)(1D、2D NMR)、質(zhì)譜技術(shù)(MS)鑒定了所有單體化合物的結(jié)構(gòu)。分別是: 5-O-methylsulochine acid(1), isosulochrin (2),ω-hydroxyemodin (citreorosein) (3),emodin-6.8- dimethyl ether (4), 4, 4'-dihydroxy- 5, 5', 7,7'- tetramethoxy- 2, 2'-dimethyl-9, 9'-bianthracene- 10, 10'(9H, 9'H)-dione (5), 4, 4'-dihydroxy-5, 5', 7, 7'-tetramethoxy-2, 2'-dimethyl-9, 9'-bianthracene-10, 10'(9H, 9'H)-dione(6), wentilactone A (7), wentilactone B(8), wentilactone C (9)及 berkedrimane B (10)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 500 MHz核磁共振儀, TMS內(nèi)標(biāo);薄層色譜硅膠 GF254和柱色譜硅膠(100~200目;200~300目)為青島海洋化工廠分廠產(chǎn)品; Lobar LiChroprep RP-18 硅膠 (40~63 μm, Merck); 顯色劑為茴香醛硫酸溶液和碘; 所用有機(jī)溶劑為重蒸的工業(yè)級溶劑。

1.2 菌株發(fā)酵

(1) 菌株: 菌株A.versicolorEN-298分離自2013年 6月采自煙臺(tái)養(yǎng)馬島的日本仙菜(Ceramium japonicum)。通過形態(tài)學(xué)觀察與ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析,將該菌株鑒定為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。

(2) 菌株發(fā)酵: 菌種于 4℃以瓊脂–麥芽膏培養(yǎng)基保存。發(fā)酵采用改良 PDB培養(yǎng)基, 組成為: 蔗糖6.0 g, 甘露醇6.0 g, 蛋白胨1.5 g, 酵母浸粉0.9 g,含20%土豆汁的純海水300 mL。

采用1 L三角燒瓶發(fā)酵培養(yǎng), 每瓶裝液體培養(yǎng)基300 mL, 116 ℃滅菌30 min后接種。共接種液體培養(yǎng)基 18 L, 于 28 ℃恒溫, 自然光條件下培養(yǎng) 30 d,分別收集菌絲體和發(fā)酵液。

1.3 提取分離

收集發(fā)酵液約18 L, 用乙酸乙酯萃取。菌絲體晾干、粉碎后用丙酮: 水(4:1)浸泡。將丙酮蒸出, 水相用乙酸乙酯萃取, 萃取物經(jīng)薄層層析檢測發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵液萃取物一致, 合并得粗提物20.5 g。

圖1 化合物1–10的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1–10

將上述粗提物進(jìn)行硅膠VLC柱層析, 以石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇體系梯度洗脫, 經(jīng)TLC檢測合并為9個(gè)組分(Fr.1-9)。其中組分Fr.4經(jīng)反相硅膠柱層析, Sephadex LH-20(甲醇)凝膠柱層析與反相硅膠柱層析分離得到化合物1(13.0 mg), 2(40.0 mg), 3(5.0 mg),4(5.5 mg), 5(8.0 mg), 6(6.5 mg); 組分Fr.5經(jīng)反相硅膠柱層析, 制備薄層層析(pTLC)分離得到化合物7(8.0 mg), 8(5.8 mg); 組分Fr.6經(jīng)反相硅膠柱層析,正相硅膠柱層析和制備高效液相(pHPLC)得到化合物 9(8.0 mg), 10(25.0 mg)。

1.4 抑菌活性MIC測試

(1) 病原指示菌: 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda), 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 哈氏弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。

(2) 指示菌菌懸液制備: 指示菌接種于LB培養(yǎng)基表面, 于37 ℃培養(yǎng)24 h后, 吸取2 mL無菌0.85 %NaCl溶液洗滌培養(yǎng)物, 并用玻璃刮刀將菌刮下。用移液槍吸取適量菌懸液于無菌試管中, 然后用0.85 % NaCl溶液將菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于1.5×108CFU/mL)

(3) 抑菌活性 MIC測試: 采用微量肉湯稀釋法[3],測定化合物的抗菌活性。以氯霉素為陽性對照, 采用無菌操作, 將倍比稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中, 每孔5 μL。然后取95 μL麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的指示菌懸液, 依次加入到96孔板中。輕輕震蕩后, 將 96孔板置于 37 ℃培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)24 h, 在600 nm波長下使用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光值, 以完全抑制指示菌生長的最低樣品濃度為該化合物的MIC值。

2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定與抗菌活性

化合物 1: 黃色固體, UV (MeOH)λmax(logε)202 (4.50), 282 (4.09) nm;1H-NMR (500 MHz,acetone-d6)δH: 6.68 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-4); 7.11 (1H,d,J= 2.7 Hz, H-6); 3.73 (3H, s, H-9); 3.87 (3H, s,H-10); 3.73 (3H, s, H-11); 6.21 (2H, br s, H-3'/5'); 2.23(3H, s, H-7');13C-NMR(100 MHz, acetone-d6)δC:129.5 (C-1, C); 125.2 (C-2, C); 158.2 (C-3, C); 103.5(C-4, CH); 161.2 (C-5, C); 106.1 (C-6, CH); 198.6(C-7, C); 166.6 (C-8, C); 52.3 (C-9, CH3); 56.0 (C-10,CH3); 56.6 (C-11, CH3); 110.4 (C-1′, C); 161.8 (C-2′/6′,C); 108.7 (C-3′/5′, CH); 147.4 (C-4′, C); 21.9 (C-7′,CH3)。其波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道值一致[3,7], 因此將該化合物鑒定為5-O-methyl sulochine。

化合物2: 橙黃色固體, UV (MeOH)λmax(logε)201 (4.30), 281 (3.92) nm;1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δH: 6.67 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-4); 6.99 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-6); 3.66 (3H, s, H-9); 3.82 (3H, s, H-10);6.19 (2H, s, H-3'/5'); 2.20 (3H, s, H-7');13C-NMR (100 MHz, acetone-d6)δC: 131.3 (C-1, C); 127.8 (C-2, C);156.5 (C-3, C); 107.1 (C-4, CH); 161.7 (C-5, C); 107.2(C-6, CH); 201.3 (C-7, C); 167.5 (C-8, C); 52.8 (C-9,CH3); 56.5 (C-10, CH3); 111.3 (C-1', C); 163.5 (C-2'/6',C); 109.4 (C-3'/5', CH); 148.8 (C-4', C); 22.5 (C-7',CH3)。其波譜數(shù)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道值一致[4], 因此將該化合物鑒定為isosulochrin。

化合物 3: 黃色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)201 (3.90), 221 (3.96) nm, 251 (3.74);1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δH: 12.14 (1H, s, 1-OH); 7.32 (1H, s,H-2); 4.77 (2H, s, 3-CH2OH); 7.72 (1H, s, H-4); 7.28(1H, d,J= 2.4 Hz, H-5); 6.56 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-7);12.2 (1H, 8-OH);13C-NMR (100 MHz, acetone-d6)δC:162.1 (C-1, C); 120.5 (C-2, CH); 152.2 (C-3, C); 117.3(C-4, CH); 131.2 (C-4a, C); 110.8 (C-5, CH); 165.6(C-6, C); 107.9 (C-7, CH); 165.6 (C-8, C); 109.7 (C-8a,C); 190.0 (C-9, C); 114.7 (C-9a, C); 181.8 (C-10, C);133.6 (C-10a, C); 62.9 (3-CH2OH)。其波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn) 報(bào) 道 值[5]一 致, 鑒 定 為 ω-hydroxyemodin(citreorosein)。

化合物4: 淡黃色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)201 (3.27), 224 (3.35) nm, 275 (3.10);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 7.06 (1H, s, H-2); 7.55 (1H, s, H-4);7.44 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-5); 6.76 (1H, d,J= 2.5 Hz,H-7); 2.42 (3H, s, 3-Me); 3.98 (3H, s, 6-OMe); 4.01(3H, s, 8-OMe); 13.07 (1H, s, 1-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC: 162.7 (C-1, C); 124.8 (C-2, CH);146.9 (C-3, C); 119.9 (C-4, CH); 104.0 (C-5, CH);165.3 (C-6, C); 104.8 (C-7, CH); 163.0 (C-8, C); 184.7(C-9, C); 182.9 (C-10, C); 132.4 (C-4a, C); 115.3 (C-8a,C); 114.8 (C-9a, C); 132.4 (C-10a, C); 21.9 (3-Me);56.0 (6-OMe); 56.6 (8-Me)。其波譜數(shù)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道值[6]一致, 因此將該化合物鑒定為 emodin-6.8-dimethyl ether。

化合物 5: 黃色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)257 (4.28), 270 (4.36) nm, 363 (4.35);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 6.36 (1H, br s, H-2); 6.71 (1H, br s,H-4); 5.38 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-5); 6.73 (1H, d,J=2.3 Hz, H-7); 4.37 (1H, s, H-9); 3.62 (3H, s,1-OMe);3.77 (3H, s, 3-OMe); 2.42 (3H, s, 6-Me);12.78 (1H, s, 8-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC:163.7 (C-1, C);99.2 (C-2, CH); 162.9 (C-3, C); 106.4(C-4, CH); 119.7 (C-5, CH); 146.1 (C-6, C); 116.2(C-7,CH); 162.0 (C-8, C); 56.7 (C-9, C); 187.5 (C-10, CH);141.6 (C-4a, C); 117.1 (C-8a, C); 143.6 (C-9a, C);114.8 (C-10a, C); 55.6 (1-OMe); 57.6 (3-OMe); 22.4(6-Me);。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道值[7]一致, 因此將該化合物鑒定為8, 8'-dihydroxy-1, 1',.3, 3'-tetramethoxy-6, 6'-dimethyl-10, 10'-bianthrone。

化合物6: 淡黃色粉末, UV (MeOH)λmax(logε)258 (4.30), 274 (4.34) nm, 362 (4.27);1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 6.44 (1H, br s, H-2); 5.95 (1H, br s,H-4); 6.00 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-5 ); 6.67 (1H, d,J=2.2 Hz, H-7); 4.26 (1H, s, H-9); 3.90 (3H, s, 1-OMe);3.77 (3H, s, 3-OMe); 2.26 (3H, s, 6-Me); 12.65 (1H, s,8-OH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δC: 163.0 (C-1,C); 99.7 (C-2, CH); 164.0 (C-3, C); 106.3 (C-4, CH);120.4 (C-5, CH); 145.8 (C-6, C); 116.6 (C-7, CH);162.3 (C-8, C); 57.9 (C-9, C); 187.2 (C-10, CH); 146.1(C-4a, C); 116.3 (C-8a, C); 115.7 (C-9a, C); 139.9(C-10a, C); 56.4 (1-OMe); 55.6 (3-OMe); 22.3 (6-Me)。其波譜數(shù)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道值[7]一致, 因此將該化合物鑒定為 8, 8'-dihydroxy-1, 1', 3, 3'-tetramethoxy-6,6'-dimethyl-10, 10'-bianthrone。

抗菌活性測定: 對分離得到的化合物進(jìn)行了抗菌活性測試, 受試菌包括溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda),副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈氏弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。測試結(jié)果表明化合物 10對遲緩愛德華氏菌表現(xiàn)出一定的抑制活性, 其 MIC值為16 μg/mL。該抑菌活性為首次報(bào)道。

[1] Jesen P R, Fenical W.Strategies for the discovery of secondary metabolities from marine bacteria,Ecological perspectives [J].Annu.Rev.Microbiol,1994, 48: 559-563.

[2] 關(guān)美君, 丁源, 林文瀚.海洋藥物——二十一世紀(jì)中國藥物研究的新熱點(diǎn)[A]//中國第六屆海洋湖沼藥物學(xué)術(shù)開發(fā)研討會(huì)論文集.浙江: 中國海洋學(xué)會(huì), 2001.

[3] 孫好芬.兩株熱帶馬尾藻內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究[D].青島: 中國科學(xué)院海洋研究所, 2010.

[4] Shimada A, Takahashi I, Kawano T, et al.Chloroisosulochrin; chloroisosulochrin dehydrate and pestheic acid,plant growth regulators, produced byPestalotiopsis theae[J].Z.Naturforsch, 2001, 56: 797-803.

[5] Fujimoto H, Nakamura E, Okuyama E, et al.Six immunosuppressive features from an ascomycete,Zopfiella longicaudata, founding in a screening study monitored by immunomodulatory activities [J].Chem.Pharm.Bull., 2004, 52(8): 1005-1008.

[6] Delle Monache G, De Rosa MC, Scurria R, et al.Metabolites from in vitro cultures of cassia didymobotrya [J].Phytochemistry, 1991, 30(6): 1849-1854.

[7] Assante G, Camarda L, Nasini G, et al.Secondary mold metabolites IX structure of a new bianthroneand of three new secoanthraquinones fromAspergillus wentiiWehmer[J].Gazz Chim Ital, 1980, 110: 629-633.

[8] Dorner J W, Cole R J, Springer J P, et al.Isolation and identification of two biologically active norditerpene dilactones fromAspergillus wentii[J].Phytochemistry,1980, 19: 1157-1161.

[9] Barrero A F, Heerrador M.M, Quilea del moral J F, et al.A convenient synthesis of a-ring-functionalizedpodolactones, revision on the structure of Wentilactone B [J].Org Lett, 2002, 4: 1379-1382.

[10] Sun H F, Li X M, Meng L.et al.Asperolides A–C,tetranorlabdane deterpenoids from the marine alga-derived endophytic fungusAspergillus wentii48[J].J.Nat.Prod., 2012, 75(2): 148-152.

[11] Donald B.Stierle, Andrea A.Stierle, Teri Girtsman,Girtsman, et al.Caspase-1 and -3 inhibiting drimane sesquiterpenoids from the extremophilic fungusPenicillium[J].J.Nat.Prod., 2012, 75(1): 262-266.