張 熙，尉春艷，古 茹，周 樂

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004 1神經(jīng)外科；2婦產(chǎn)科；3手術(shù)麻醉科

神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷是目前的研究熱點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞具備以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)在不同微環(huán)境中可分化為不同功能的細(xì)胞，即多分化潛能；2)可在移植區(qū)域釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，優(yōu)化損傷區(qū)域內(nèi)神經(jīng)功能恢復(fù)的內(nèi)環(huán)境；3)可以免受大多數(shù)的繼發(fā)性損傷分子的影響。我們的前期研究證明，腦外傷后側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力明顯增加[1]，但是在修復(fù)過程中仍然面臨著體內(nèi)增殖、定向分化以及穿越膠質(zhì)屏障重建突觸連接等一系列困難。研究表明，T型鈣通道與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[2-3]，抑制T型鈣通道的表達(dá)可抑制細(xì)胞周期蛋白，如Cyclin A、Cyclin D蛋白等，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞的增殖。米貝地爾是特異性的T型鈣通道阻滯劑。本實(shí)驗(yàn)通過研究體外條件下T型鈣通道阻滯劑米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，間接闡明T型鈣通道在神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用。

材料和方法

1 主要材料與試劑 成年8周齡SD大鼠6只，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量200 ～ 250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(50μg)，重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(10μg)購自GIBICO公司，Nestin抗體(0.1 ml)，GFAP抗體(0.1 ml)，NSE抗體(0.1 ml)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，米貝地爾(5 mg)購自Sigma公司。

2 腦損傷動(dòng)物模型的建立 按文獻(xiàn)[4]的方法，用液壓損傷法建立腦損傷動(dòng)物模型。用0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下，沿頭顱矢狀縫做長約1 cm的正中切口，暴露顱骨外板，在頭顱立體定位儀引導(dǎo)下，在冠狀縫后2.3 mm，矢狀縫旁開1.5 mm的右側(cè)頂葉選取坐標(biāo)點(diǎn)，用顱骨鉆打開顱板，顯示硬腦膜，將打擊管埋置于硬腦膜外，并用牙托水泥固定。24 h后以0.2 MPa的壓力沖擊右側(cè)頂葉皮質(zhì)造成中度側(cè)位液壓沖擊腦損傷。

3 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將腦損傷術(shù)后7 d的成年大鼠，用0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下暴露腦并剝離硬腦膜，以室下區(qū)為中心，迅速切除長1.0 ～ 1.5 cm腦組織，取出置入冷凍的D-hanks液中，沿側(cè)腦室面切取室下區(qū)，修去損傷區(qū)附近的腦組織后，盡量剪成0 ～ 1 mm3的組織碎屑。將這些室下區(qū)碎屑移入含有0.1%的胰蛋白酶、0.67mg/ml的透明質(zhì)酸酶和0.1 mg/ml DNA酶的混合酶液中，在培養(yǎng)箱(37℃，95% O2和5% CO2)中消化30 min后，移入預(yù)先已加有等體積的0.125%的大豆胰酶抑制劑的離心管內(nèi)，反復(fù)吹打，盡可能地將殘余的室下區(qū)組織小塊機(jī)械性分離開來。銅網(wǎng)過濾。將濾過的液體收集入離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，棄去上清液。然后再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，800 r/min離心5 min。如此反復(fù)重復(fù)5 ～ 6次后，用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞活力后，調(diào)整細(xì)胞密度為50 000 ～ 100 000/ml，種入培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮培養(yǎng)。接種24 h后換1次培養(yǎng)液，以后每隔7 d半量換液。以上過程均在無菌間內(nèi)完成。

4 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 單細(xì)胞懸液接種在事先用多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)2 h后，行抗Nestin免疫染色。培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球用機(jī)械法傳代以鑒定自我增殖能力。將培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液/神經(jīng)球接種在包被有多聚賴氨酸的蓋玻片上，用含有10%胎牛血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)。24 h后隨機(jī)分為兩組：第一組行抗GFAP免疫染色，第二組行抗NSE免疫染色。

5 米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞球的影響 取第二代細(xì)胞，獲取單細(xì)胞懸液，37℃孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基中分別加入米貝地爾0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L，37℃孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)繼續(xù)培養(yǎng)，4 d后檢測各組神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)。

6 MTT檢測 取第二代細(xì)胞，獲取單細(xì)胞懸液，以1 000 ～ 10 000/孔接種于96孔板，每孔200μl，37℃孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)培養(yǎng)24 h。將米貝地爾以0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的濃度分別加入接種有單細(xì)胞懸液的96孔板內(nèi)，按米貝地爾濃度分6組，每組6孔，液體差異以完全培養(yǎng)基補(bǔ)足。37℃孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，每孔加5 mg/ml MTT液20μl，作用4 h后將96孔板置離心機(jī)內(nèi)1 000 ～ 2 000 r/min離心5 min，使細(xì)胞球貼壁；小心吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 100μl/孔，室溫下?lián)u床震蕩10 min，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀檢測各孔570 nm波長下OD值。并根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率、增值抑制率、半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)；增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)。

7 Western blot檢測 將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中根據(jù)IC50值加入相應(yīng)濃度的米貝地爾，對(duì)照組中加入等量的PBS溶液，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。封閉2 h后與兔抗鼠Cyclin A抗體孵育過夜，二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參校正。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 細(xì)胞接種3 d后，在培養(yǎng)瓶中可發(fā)現(xiàn)有明顯的干細(xì)胞克隆球形成，在顯微鏡可見這些干細(xì)胞克隆球由數(shù)十個(gè)細(xì)胞緊密聚集而成，克隆球大小不均等，細(xì)胞邊緣光滑、中心膨隆有立體感，在形態(tài)上和簡單的細(xì)胞聚集有顯著差異(圖1)。細(xì)胞傳代后培養(yǎng)瓶中仍然可以長出類似的細(xì)胞球，且數(shù)目明顯增多，細(xì)胞碎屑明顯減少(圖2)。免疫熒光標(biāo)記顯示這些細(xì)胞球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)記物-Nestin，免疫染色呈強(qiáng)陽性(圖4)。誘導(dǎo)分化后2 h即可見部分細(xì)胞自細(xì)胞球內(nèi)向外遷移。2 d后大量細(xì)胞自細(xì)胞球內(nèi)遷移出，并開始形成短小的突起，1周后鏡下可見細(xì)胞形態(tài)成熟，可明確區(qū)分出各類神經(jīng)細(xì)胞，視野下大部分為膠質(zhì)細(xì)胞，尤以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，神經(jīng)元較少，散在分布，細(xì)胞突起相互間交織成網(wǎng)狀(圖3)。免疫熒光染色可見一部分細(xì)胞表達(dá)GFAP蛋白，一部分細(xì)胞表達(dá)NSE蛋白(圖4)。

2 米貝地爾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞球的影響 對(duì)照組細(xì)胞增殖快，鏡下見大量細(xì)胞球，細(xì)胞球形態(tài)規(guī)則，邊緣光滑，中心膨隆有立體感，未見皺縮細(xì)胞及細(xì)胞碎片。隨著米貝地爾濃度增加，鏡下細(xì)胞球數(shù)量逐漸減少，直徑也隨之減小，形態(tài)尚規(guī)則，并可見越來越多的皺縮細(xì)胞。至10μmol/L組鏡下僅見數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞球，且細(xì)胞球數(shù)目極少，周圍有大量細(xì)胞碎片。20μmol/L組鏡下未見正常形態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)球，視野中全部為死亡細(xì)胞皺縮形成的細(xì)胞碎片(圖5)。

圖1 原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)(×40)A： 第3天； B：第6天Fig. 1 Neural stem cell morphology in primary culture (×40)A: The third day; B: The sixth day

圖2 第一次傳代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)(×40)A： 第3天； B：第6天Fig. 2 Neural stem cell morphology after the f rst passage (×40)A: The third day; B: The sixth day

圖3 誘導(dǎo)分化神經(jīng)干細(xì)胞后的形態(tài)(×40)A： 第1天； B：第7天Fig. 3 Neural stem cell morphology after induction and differentiation (×40)A: The first day; B: The seventh day

圖4 免疫熒光染色神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)(×40) A： Nestin； B： GFAP； C： NSEFig. 4 Immunof uorescence staining of neural stem cell (×40)A: Nestin staining of neural stem cell sphere; B: GFAP staining of neural stem cell after induction and differentiation; C: NSE staining of neural stem cell after induction and differentiation

3 MTT檢測 與對(duì)照組相比較，1.25μmol/L組及2.5μmol/L組OD值稍降低，細(xì)胞存活率及增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5μmol/L組、10μmol/L組和20μmol/L組與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率及增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著米貝地爾濃度增加，尤其是≥5μmol/L時(shí)，其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用(圖6，表1)。計(jì)算得IC50為8.93μmol/L。

4 Cyclin A蛋白的表達(dá) 在實(shí)驗(yàn)組中加入米貝地爾，Cylclin A蛋白的表達(dá)明顯降低(圖7)。

討 論

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新能力并且能夠分化產(chǎn)生不同類型的神經(jīng)細(xì)胞，利用神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為目前的研究熱點(diǎn)。它可通過：1)產(chǎn)生外源性神經(jīng)元，橋接損傷斷端，形成功能性突觸，重新建立神經(jīng)傳導(dǎo)通路。2)分化產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞，使損傷的脫髓鞘軸索再髓鞘化，恢復(fù)有髓神經(jīng)電傳導(dǎo)功能[5]。3)分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子改善脊髓局部微環(huán)境，對(duì)神經(jīng)進(jìn)行保護(hù)及免疫抑制作用[6]。4)啟動(dòng)再生相關(guān)基因的順序表達(dá)使軸突再生，產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)，填充脊髓損傷后遺留的空腔，為再生軸突提供支持物等機(jī)制達(dá)到治療的目的。雖然理論上干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有美好前景，但實(shí)際操作中仍然面臨著許多問題，比如損傷后膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突再生，損傷局部微環(huán)境及繼發(fā)損傷不利于移植細(xì)胞存活及增殖，神經(jīng)干細(xì)胞定向分化等[7-8]。

表1 不同濃度米貝地爾作用下神經(jīng)干細(xì)胞的存活率及增殖抑制率Tab. 1 Survival rate and proliferation inhibition rate of neural stem cell in each group after adding different concentrations of mibefradil

圖5 加入不同濃度米貝地爾后各組神經(jīng)干細(xì)胞球的鑒定A： Control組 B： 1.25μmol/L組； C： 2.5μmol/L組； D： 5μmol/L組； E： 10μmol/L組； F：20μmol/L組Fig. 5 Identif cation of neural stem cell spheres in each group after adding different concentrations of mibefradilA: Control group; B: 1.25μmol/L group; C: 2.5μmol/L group; D: 5μmol/L group; E: 10μmol/L group; F: 20μmol/L group

圖6 加入不同濃度米貝地爾后各組OD值的鑒定Fig. 6 Identif cation of OD value in each group after adding different concentrations of mibefradil

圖7 兩組中Cyclin A蛋白的表達(dá)Fig. 7 Expression of Cyclin A protein in two groups

T型鈣離子通道又名低電壓激活鈣通道，它具有易激活，失活緩慢，需要的電壓閾值較低等特點(diǎn)[9-10]。T型鈣通道家族包括3種T型鈣通道亞型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3，廣泛表達(dá)于腦組織中，主要位于下橄欖核、丘腦、海馬、下丘腦、室旁核、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、小腦深部核團(tuán)、蒼白球以及丘腦底核等[11-12]。Cav3.1蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端，Cav3.2蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端至中間部分，Cav3.3蛋白主要表達(dá)于特定類型細(xì)胞的胞體及樹突[13]。研究表明，多種組織損傷后其內(nèi)部的T型鈣離子通道的表達(dá)明顯上調(diào)[14]。我們的前期研究證明，顱腦損傷后腦組織內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力明顯增加[1,15]。但是該過程是否與T型鈣離子通道有關(guān)尚無定論。本研究構(gòu)建了顱腦損傷模型，分離并培養(yǎng)側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞后，應(yīng)用T型鈣通道阻滯劑米貝地爾可明顯抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力，說明了T型鈣通道在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程中起著十分重要的作用。因此，在神經(jīng)損傷后維持T型鈣離子通道的功能，可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，有利于神經(jīng)損傷的修復(fù)。

在細(xì)胞的生長過程中，細(xì)胞只有通過了G1/S和G2/M期后才能夠進(jìn)行DNA的復(fù)制和增殖。在G1/S期，細(xì)胞需要外源性鈣離子以及鈣離子通道參與，刺激DNA復(fù)制所需的關(guān)鍵酶的分泌[14]。研究證明，T型鈣通道存在于細(xì)胞的G1/S期，在其他階段表達(dá)明顯下調(diào)[16-17]。因此，T型鈣通道在G1/S期發(fā)揮著十分重要的作用。Cyclin A的合成發(fā)生于G1期向S期的轉(zhuǎn)變過程中，在中期時(shí)消失，屬S期周期蛋白[18]。米貝地爾能夠明顯抑制Cyclin A蛋白的表達(dá)，說明它可能通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，尤其抑制是G0/G1期向S期進(jìn)展，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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