謝 芳，羅渝昆，唐 杰

解放軍總醫(yī)院 超聲科，北京 100853

肝移植是目前治療終末期肝病的一種有效方法，在此過程中供肝需經(jīng)過切取、保存和植入3個步驟，不可避免要經(jīng)歷缺血再灌注的病理生理過程。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是一個多細(xì)胞參與、多種介質(zhì)共同作用的復(fù)雜病理過程，包括缺血引起的器官損傷以及炎癥介導(dǎo)的再灌注組織損傷，是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的重要因素，嚴(yán)重影響著術(shù)后肝功能和移植物的存活?，F(xiàn)已證實，肝內(nèi)膽管細(xì)胞對缺血再灌注損傷的反應(yīng)比肝細(xì)胞更為敏感，與再灌注密切相關(guān)[1]。膽管缺血再灌注損傷主要表現(xiàn)在膽管壁和膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cell，BEC)的損傷以及膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙，臨床上可引起膽管炎、膽道狹窄，甚至出現(xiàn)膽道缺血性壞死、膽瘺。因此，進(jìn)一步了解膽管缺血再灌注損傷的機(jī)制將有助于其防治策略的研究，減少肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。

1 膽管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷

膽管上皮細(xì)胞是一族高耗氧、高代謝、缺氧耐受能力差的細(xì)胞群體，僅占肝細(xì)胞總數(shù)的3% ～ 5%，形態(tài)和功能上都具有多樣性。線粒體是細(xì)胞的活性代謝中心，對各種損傷因子極為敏感，是最常見的用于觀察超微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器之一。在許多病理性損傷因子(缺血、缺氧)的作用下，線粒體首先受損，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)迅速耗竭，進(jìn)而損傷整個細(xì)胞的功能。因此，超微結(jié)構(gòu)的觀察是研究肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞IRI的一個重要手段。實驗表明，膽管上皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察可反映膽道組織IRI的程度[2]。缺血缺氧時，膽管上皮細(xì)胞基底膜脫落，同時中性粒細(xì)胞浸潤，線粒體腫脹、數(shù)量減少，細(xì)胞核皺縮，炎細(xì)胞浸潤。再灌注后，鈣超載與氧自由基大量生成，二者相互影響、協(xié)同作用，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷進(jìn)一步加重，微絨毛逐漸減少，甚至消失，線粒體膜結(jié)構(gòu)和骨架破壞，通透性增加，能量代謝障礙，直接造成了膽管上皮細(xì)胞的損傷。

2 膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙

膽管的動脈血供相當(dāng)復(fù)雜，隨著肝膽外科的發(fā)展，肝動脈的終末分支—膽管周圍毛細(xì)血管叢(peribiliary blood plexus，PBP)作為膽管直接的血供來源，在維持其正常生理功能中的作用越來越受到重視[3]。肝細(xì)胞接受門靜脈和肝動脈的雙重血供，血管腔較大；而膽管只接受肝動脈分支PBP的血供，管腔較細(xì)，因而在IRI時，膽管細(xì)胞受到的傷害比肝細(xì)胞更加嚴(yán)重。黃志強(qiáng)和黃曉強(qiáng)[4]通過觀察兔肝微血管鑄型掃描電鏡也證實了PBP的這種血流灌注特點，這正是肝移植術(shù)后肝動脈血流通暢但卻會發(fā)生缺血性膽管狹窄的解剖學(xué)原因。肝移植過程中，供肝冷凍保存時間過長，可直接損害肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，并破壞PBP的微循環(huán)。在原位肝移植手術(shù)過程中，膽管還要經(jīng)歷兩個階段的熱缺血損傷[5]，一是供肝切取過程中的短暫熱缺血損傷，二是門靜脈血流開放至肝動脈血流開放過程中的肝動脈缺血損傷。在此期間，肝尚有門靜脈單純血供，而膽管仍處于熱缺血狀態(tài)，因此，膽管缺血再灌注損傷更加明顯。病理實驗證實，門脈區(qū)膽管上皮細(xì)胞損傷程度與二次熱缺血時間密切相關(guān)[6]。

3 膽管上皮細(xì)胞的炎癥損傷

現(xiàn)已證實，結(jié)構(gòu)特殊的膽管也是冷、熱缺血及再灌注損傷的重要靶組織。目前認(rèn)為，缺血再灌注損傷的機(jī)制與鈣超載、氧自由基增多及炎性細(xì)胞聚集等有關(guān)。缺血期，由于組織缺氧導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，ATP耗竭及微循環(huán)障礙，膽管上皮細(xì)胞脫落，微絨毛數(shù)量減少，甚至出現(xiàn)黏膜全層水腫、壞死、纖維化形成而致狹窄。隨著再灌注時間的延長，中性粒細(xì)胞不斷聚集，組織損傷反而加劇，進(jìn)而引起一系列炎癥反應(yīng)，并且生成的氧自由基和蛋白酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞損傷放大效應(yīng)[7]。許多炎癥介質(zhì)參與了膽管IRI這一復(fù)雜的病理生理過程，如激活的枯氏細(xì)胞、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)、5-羥色胺、血小板活化因子、內(nèi)皮素、一氧化氮、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、前列腺素、趨化因子和黏附分子等。這些介質(zhì)通過自分泌、旁分泌或類似激素的方式誘導(dǎo)其自身及其他因子產(chǎn)生，形成一個細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子鏈，使膽管上皮細(xì)胞的損傷呈進(jìn)行性加重。膽管上皮細(xì)胞來源的5-羥色胺(5-HT)以及門管區(qū)成纖維細(xì)胞來源的TGF-β介導(dǎo)了BEC與成纖維細(xì)胞之間的自分泌與旁分泌效應(yīng)，以維持BEC的增殖，在膽管病發(fā)病機(jī)制中具有重要的意義[8]。此外，由于膽管上皮細(xì)胞內(nèi)缺乏抗氧化酶系，如過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽，因而較肝細(xì)胞更容易受到再灌注時氧自由基的損傷。

肝移植缺血再灌注損傷后，PBP和其內(nèi)皮細(xì)胞也廣泛參與了膽管免疫炎癥反應(yīng)的病理過程，包括血管通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、血管收縮、血細(xì)胞淤塞以及補體系統(tǒng)的激活，其中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血小板—白細(xì)胞聚合物進(jìn)一步加劇了PBP的微循環(huán)障礙。

4 膽管上皮細(xì)胞的免疫學(xué)損傷

肝是最重要的具有天然免疫功能的器官，它通過門靜脈接收并過濾其他系統(tǒng)80%的血液。再灌注損傷后，膽管上皮細(xì)胞積極參與肝內(nèi)免疫介導(dǎo)的無菌性炎癥，激活炎癥細(xì)胞；并通過自身免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)主要組織相容性抗原分子的上調(diào)或表達(dá)，完成抗原提呈過程；分泌和表達(dá)促炎性細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子及黏附分子，激活天然和獲得性免疫反應(yīng)，引發(fā)移植物損傷，使膽管成為肝移植后膽道并發(fā)癥的靶器官[9]。

目前，在缺血再灌注免疫損傷中研究較多的是Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)，它是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)，也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR廣泛表達(dá)于肝的實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞，包括肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯氏細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及星狀細(xì)胞，對肝及膽道的功能起著至關(guān)重要的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，TLR不僅可識別外源性病原體，如疾病相關(guān)分子模式，還能夠識別機(jī)體自身產(chǎn)生的內(nèi)源性配體，即損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattems，DAMPs)，并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答[10]。DAMPs通常隱藏于細(xì)胞內(nèi)，缺血再灌注損傷后，被一些受損或死亡的細(xì)胞激活，釋放到細(xì)胞外而引起免疫反應(yīng)。也有證據(jù)表明，細(xì)胞外的DAMPs是在代謝過程中生成或釋放的，缺血再灌注損傷時，這種在分解代謝中產(chǎn)生的DAMPs既可以激活免疫反應(yīng)，也可以作為一個安全信號，抑制有害的免疫反應(yīng)，而保護(hù)組織的完整性[11-12]。最近的研究表明，TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對天然免疫及獲得性免疫均有重要的調(diào)控作用[13]。TLR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎參與了所有的肝疾病，如急性和慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝缺血再灌注損傷、肝再生和肝細(xì)胞癌。TLR被配體識別后，激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B、促分裂原活化蛋白激酶以及Ⅰ型干擾素信號通路，分泌促炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-6、IL-1β)和化學(xué)趨化因子，從而調(diào)節(jié)機(jī)體輔助性T細(xì)胞的平衡[9]。

枯氏細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞及NK/ NKT細(xì)胞也都參與了缺血再灌注損傷引起的免疫反應(yīng)。目前，T細(xì)胞在無菌性炎癥環(huán)境下被激活的機(jī)制仍然沒有深入了解，但證據(jù)表明，T細(xì)胞激活具有抗原特異性及抗原獨立性[14]。實驗表明，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞參與了腸道組織缺血再灌注損傷的過程[15]，CD2和CD28 T淋巴細(xì)胞在鼠肺缺血再灌注損傷中均具有損傷的作用[16]；補體調(diào)節(jié)蛋白CD59在小鼠腦缺血再灌注24 h后顯著降低，其可能也參與了腦缺血再灌注的免疫損傷過程[17]。

5 膽管缺血再灌注損傷的影像學(xué)診斷及防治

目前，臨床上診斷膽管疾病主要依靠各種影像學(xué)手段，包括ERCP、PTC、MRCP和超聲，都是通過顯示膽管狹窄、擴(kuò)張等形態(tài)學(xué)改變來診斷。而超聲檢查具有無輻射、經(jīng)濟(jì)便捷、實時動態(tài)、可用于術(shù)中及床旁等顯著優(yōu)勢，已成為膽道疾病首選的影像學(xué)檢查之一[18]。由于膽道系統(tǒng)的特殊性，超聲造影劑不僅可以通過靜脈，還能經(jīng)膽管腔內(nèi)注入，從而觀察膽管腔外和腔內(nèi)的結(jié)構(gòu)。鄭榮琴等應(yīng)用經(jīng)靜脈注入超聲造影劑對膽管壁微循環(huán)灌注進(jìn)行實時、無創(chuàng)觀測，通過檢測膽管周圍毛細(xì)血管叢的血流灌注狀態(tài)對膽道缺血進(jìn)行評價，其改變可能早于形態(tài)學(xué)變化[19]。Nunoi等[20]結(jié)合超聲造影與彩色多普勒，為門脈性膽道病的診斷及鑒別診斷提供了直觀而特異的形態(tài)學(xué)檢查方法，避免了病人遭受膽道活檢和外科手術(shù)的痛苦。盡管如此，超聲造影對于膽道炎癥、缺血性病變的診斷價值還缺乏更多的相關(guān)證據(jù)。因此，筆者認(rèn)為超聲造影對于膽道病變的診斷價值還有待進(jìn)一步深入研究。

過去10年，對于再灌注損傷的機(jī)制研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，而且也提出了很多確實有效的策略來預(yù)防缺血或再灌注損傷[21-22]。缺血預(yù)適應(yīng)就是一種重要的臨床治療方法[23]。新近一項研究報道，肝切除術(shù)前采取多次間斷缺血、再灌注，較單純?nèi)毖A(yù)適應(yīng)可更加有效地減輕肝組織損傷，而且，缺血與再灌注間隔時間越短，肝損傷越小[24]。實驗研究表明，低溫機(jī)器灌注與經(jīng)典的靜態(tài)冷藏器官保存方法相比，可更好地保護(hù)肝實質(zhì)，防止膽管周圍血管叢小動脈壞死，有助于更快地恢復(fù)缺血性膽管的血流再灌注[22]。除此之外，大量的藥物實驗研究模擬缺血預(yù)處理的機(jī)制，為缺血再灌注損傷治療提供了新的強(qiáng)有力的依據(jù)。例如，應(yīng)用脯氨酸羥化酶抑制劑或腺苷受體激動劑調(diào)控能量代謝過程可以增加組織缺血耐受力[25-26]；在冠狀動脈旁路移植術(shù)前應(yīng)用激活的線粒體醛脫氫酶可增強(qiáng)患者心肌缺血的耐受性[27]。實驗證明，一些治療性的氣體包括氫氣、一氧化氮、硫化氫和一氧化碳也可以減輕再灌注損傷[28]。另外，Sheng等[29],研究報道，植入自體骨髓單核細(xì)胞能夠顯著減少肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的凋亡，從而預(yù)防及減少肝內(nèi)膽道缺血的發(fā)生。缺血再灌注損傷的干預(yù)及治療措施目前已進(jìn)入了臨床試驗階段，其安全性和有效性正在論證。一些藥劑已經(jīng)在小型臨床試驗中取得了非常好的結(jié)果，但仍需要大樣本的臨床研究證實。

6 展望

膽道缺血再灌注損傷在肝移植后的發(fā)生率仍然很高。只有深入理解缺血再灌注損傷的炎癥免疫學(xué)機(jī)制，深入闡釋缺血再灌注損傷與膽管疾病之間的關(guān)系，利用更完善的外科技術(shù)及更有效的預(yù)防治療策略，才會減少肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。低溫機(jī)器灌注已經(jīng)受到了越來越多的研究和關(guān)注，具有潛在的優(yōu)勢，可以更好地保護(hù)脆弱的膽管。目前，大多數(shù)研究表明，這種技術(shù)(如溫度、時間等)還需要探索與改善。盡管如此，低溫機(jī)器灌注仍然具有良好的前景，有可能成為一種新技術(shù)，有效地減少膽道缺血再灌注的損傷。盡管未來還有很大的挑戰(zhàn)，我們還是希望有更好的探索及新的療法應(yīng)用于缺血再灌注損傷的臨床實踐中，推動肝移植的發(fā)展。

1 Emadali A， Muscatelli-Groux B， Delom F， et al. Proteomic analysis of ischemia-reperfusion injury upon human liver transplantation reveals the protective role of IQGAP1［J］. Mol Cell Proteomics，2006， 5（7）：1300-1313.

2 王洪波，儲芳，孫艷玲，等.肝移植術(shù)中不同時相供肝膽道上皮細(xì)胞的病理組織結(jié)構(gòu)改變［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2012， 11（7）：489-491.

3 黃志強(qiáng).當(dāng)今膽道外科的發(fā)展與方向［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2007，21（10）：10-12.

4 黃志強(qiáng)，黃曉強(qiáng).重視膽管、膽管細(xì)胞與移植肝膽道病的研究［J］.消化外科，2006，5（1）：1-6.

5 Zhu XH， Pan JP， Wu YF， et al. Establishment of a rat liver transplantation model with prolonged biliary warm ischemia time［J］. World J Gastroenterol， 2012， 18（48）： 7194-7200.

6 Zhu XH， Pan JP， Wu YF， et al. Effects of warm ischemia time on biliary injury in rat liver transplantation［J］. World World J Gastroenterol， 2012， 18（43）： 6308-6314.

7 Zhai Y， Busuttil RW， Kupiec-Weglinski JW. Liver ischemia and reperfusion injury： new insights into mechanisms of innate-adaptive immune-mediated tissue inflammation［J］. Am J Transplant，2011， 11（8）： 1563-1569.

8 陳莉萍，王雅文，樊文梅，等.5-羥色胺在膽管上皮細(xì)胞與門管成纖維細(xì)胞自分泌/旁分泌中的作用［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35（10）：1044-1048.

9 Eltzschig HK， Eckle T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation［J］. Nat Med， 2011， 17（11）：1391-1401.

10 Chen GY， Nu?ez G. Sterile inflammation： sensing and reacting to damage［J］. Nat Rev Immunol， 2010， 10（12）： 826-837.

11 Mcdonald B， Pittman K， Menezes GB， et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation［J］. Science， 2010， 330（62）： 362-366.

12 Grenz A， Homann D， Eltzschig HK. Extracellular adenosine： a safety signal that dampens Hypoxia-Induced inflammation during ischemia［J］. Antioxid Redox Signal， 2011， 15（8）： 2221-2234.

13 Chen YY， Sun R. Toll-like receptors in acute liver injury and regeneration［J］. Int Immunopharmacol， 2011， 11（10）： 1433-1441.

14 Shen XD， Wang YE， Gao F， et al. CD4 T cells promote tissue inflammation via CD40 signaling without De Novo activation in a murine model of liver ischemia/reperfusion injury［J］. Hepatology，2009， 50（5）： 1537-1546.

15 Yang DJ， Zhu ZX， Fu HB， et al. Hypertonic saline activates CD4+ and CD8+ T-lymphocytes in the small intestine to alleviate intestinal ischemia-reperfusion injury［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014， 18（20）：3069-3075.

16 Gao W， Liu DD， Li D， et al. Effects of hypercapnia on T cells in lung ischemia/reperfusion injury after lung transplantation［J］. Exp Biol Med， 2014， 239（12）： 1597-1605.

17 趙軍，晏沐陽，張傳福，等.CD59在小鼠腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)及意義［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（4）：373-375.18 Sparchez Z， Radu P. Role of contrast enhanced ultrasound in the assessment of biliary duct disease［J］. Med Ultrason， 2014， 16（1）：41-47.

19 Zhang YC， Qu EZ， Ren J， et al. New diagnosis and therapy model for Ischemic-Type biliary lesions following liver Transplantation-A retrospective cohort study［J］. PLoS One， 2014， 9（9）： e105795.

20 Nunoi H， Hirooka M， Ochi H， et al. Portal biliopathy diagnosed using color doppler and contrast-enhanced ultrasound［J］. Intern Med， 2013， 52（10）： 1055-1059.

21 Papadopoulos D， Siempis T， Theodorakou E， et al. Hepatic ischemia and reperfusion injury and trauma： current concepts［J］. Arch Trauma Res， 2013， 2（2）：63-70.

22 Den Dries SO， Sutton ME， Karimian N， et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion prevents arteriolonecrosis of the peribiliary plexus in pig livers donated after circulatory death［J］. PLoS One， 2014， 9（2）： e88521.

23 Adam AN. Some mechanisms of the protective effect of ischemic preconditioning on rat liver ischemia-reperfusion injury［J］. Int J Gen Med， 2014， 7：483-489.

24 Seyama Y， Imamura H， Inagaki YA， et al. Intermittent clamping is superior to ischemic preconditioning and its effect is more marked with shorter clamping cycles in the rat liver［J］. J Gastroenterol，2013， 48（1）： 115-124.

25 Hill P， Shukla D， Tran MG， et al. Inhibition of hypoxia inducible factor hydroxylases protects against renal ischemia-reperfusion injury［J］. J Am Soc Nephrol， 2008， 19（1）： 39-46.

26 Bernhardt WM， Wiesener MS， Scigalla P， et al. Inhibition of prolyl hydroxylases increases erythropoietin production in ESRD［J］. J Am Soc Nephrol， 2010， 21（12）：2151-2156.

27 Chen CH， Budas GR， Churchill EN， et al. Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damage to the heart［J］. Science， 2008， 321（5895）： 1493-1495.

28 Lanford RE， Hildebrandt-Eriksen ES， Petri A， et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection［J］. Science， 2010， 327（5962）：198-201.

29 Sheng QS， Chen WB， Lin JJ， et al. Effects of autologous bone marrow mononuclear cells implantation on cholangiocytes apoptosis in model of intrahepatic ischemic type biliary lesion in rabbits［J］. Transplant Proc， 2012， 44（5）： 1435-1438.