劉晨　劉安軍　馬艷弘　等

摘要：研究藍(lán)莓酒渣中花色苷的超聲波輔助提取工藝及花色苷的抗氧化活性，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取工藝，建立了花色苷提取的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，測定了其抗DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力。結(jié)果表明：藍(lán)莓酒渣花色苷的最佳提取條件為超聲時(shí)間50 min、液料比33 mL ∶1 g、提取溫度 65 ℃，在此條件下，藍(lán)莓酒渣花色苷的提取率為6.092 mg/g，所提酒渣花色苷具有較好的抗氧化活性，0.16 mg/mL花色苷提取液對DPPH自由基的清除率達(dá)81.7%，抗超氧陰離子自由基能力達(dá)220.89 U/L，對羥自由基的抑制率為82.40%。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓酒渣；花色苷；超聲波輔助；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號： Q946.91+9；O657.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0242-05

收稿日期：2014-08-29

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK2012786）；南京市生物農(nóng)業(yè)項(xiàng)目。

作者簡介：劉晨（1990—），女，山東樂陵人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：jgee39@sina.com。

通信作者：馬艷弘，博士，副研究員，主要從事發(fā)酵食品與副產(chǎn)物綜合利用研究。Tel：（025）84391287；E-mail：ma_yhhyy@126.com。藍(lán)莓為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium spp.）植物，是21世紀(jì)的功能性保健漿果，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）列為人類五大健康食品之一，富含花青素、黃烷醇、酚酸等多種活性物質(zhì)[1-3]，有抗氧化、抗炎、抗癌、護(hù)肝、抗衰老、軟化血管、保護(hù)視力、增強(qiáng)人機(jī)體免疫力等多種藥理保健功效[4-8]，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景。藍(lán)毒花青素（anthocyanins）是藍(lán)莓藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，屬黃酮類化合物，常以半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、蕓香糖苷等花色苷形式存在[9-10]。

隨著消費(fèi)者對藍(lán)莓營養(yǎng)保健功能認(rèn)識的增強(qiáng)，藍(lán)莓汁、藍(lán)莓醬、藍(lán)莓酒等相關(guān)產(chǎn)品風(fēng)靡世界，其中藍(lán)莓酒由于具有營養(yǎng)豐富、酒體醇厚、色澤艷麗、口味綿長、香氣宜人等特點(diǎn)而備受消費(fèi)者推崇。但是在藍(lán)莓酒釀造過程中產(chǎn)生的大量酒渣卻并未得到充分利用，而研究認(rèn)為，藍(lán)莓酒渣中仍含有大量花色苷，利用合理的方法提取藍(lán)莓酒渣中的花色苷、提高藍(lán)莓酒渣資源的綜合利用率是當(dāng)前加速藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑之一。

國內(nèi)外許多學(xué)者對花色苷的提取方法做了大量研究，采用的方法主要有溶劑萃取法、酶法輔助法、微波輔助法等[11-13]。借助超聲波進(jìn)行輔助提取是近年來色素提取研究中發(fā)展的新技術(shù)，這種方法可有效破碎植物細(xì)胞壁，具有色素溶出快、提取時(shí)間短、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)[14-19]。眾多的研究主要集中在藍(lán)莓果實(shí)中花色苷的分離提取，而對于藍(lán)莓酒渣中花色苷的高效提取技術(shù)還鮮見報(bào)道，因此本試驗(yàn)利用超聲波輔助提取法，通過響應(yīng)面分析法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并探討其抗氧化活性，以期為提高藍(lán)莓酒渣綜合利用率提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

藍(lán)莓酒渣，由江蘇省句容市萬山紅遍生物科技有限公司提供；25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，陜西森弗天然制品有限公司；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純試劑。

1.2儀器設(shè)備

DHG-9070電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器，常州國華儀器有限公司；KH-500E超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；D-B分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ZD-F12真空冷凍干燥機(jī)，南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藍(lán)莓酒渣花色苷超聲提取工藝將藍(lán)莓酒渣平鋪于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于45 ℃烘干至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎后過80目篩。取干粉按一定比例加入檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3），浸泡10 min后置于超聲波清洗器中進(jìn)行不同時(shí)間的超聲處理。然后置于不同溫度磁力攪拌器中避光提取1 h，抽濾，回收濾渣，加入同體積提取液，在相同溫度下再提取1次，合并2次上清液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，選用AB-8大孔樹脂進(jìn)行純化[20]，流速2 mL/min，待回收液吸光度值達(dá)上樣提取液吸光度值10%時(shí)停止上樣。用蒸餾水洗去樹脂未吸附雜質(zhì)，并采用考馬斯法和硫酸苯酚法分別測定回收液中蛋白質(zhì)含量和還原糖含量，當(dāng)二者無檢出時(shí)，用檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3）進(jìn)行洗脫。收集洗脫液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，真空包裝后于4 ℃避光貯藏備用。

1.3.2藍(lán)莓酒渣花色苷提取率的測定采用pH示差法[21]測定花色苷含量。準(zhǔn)確吸取1mL待測提取液于具塞試管中，再分別加入4 mL pH值為1.0、4.5的緩沖液，避光條件下放置60 min達(dá)平衡，利用分光光度計(jì)分別測量520、700 nm處的吸光度值。

提取液花色苷含量計(jì)算公式：

C=ΔD×M×n×Vε×1×m×1 000；

ΔD=[（D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0）-（D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）]

式中：C為花色苷含量，mg/g；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；m為樣品質(zhì)量，g；l為光程，1 cm。

實(shí)際測定后，將計(jì)算結(jié)果換算為1 g藍(lán)莓酒渣中含有花色苷的質(zhì)量（mg）。

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)以藍(lán)莓酒渣花色苷提取率為考察目標(biāo)，以檸檬酸酸化的70%乙醇溶液（體積含量，pH值為3）為提取液，在超聲功率500 W的條件下，考察不同超聲時(shí)間、液料比、提取時(shí)間對花色苷提取率的影響，提取條件的單因素設(shè)計(jì)見表1。 表1藍(lán)莓酒渣花色苷提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

因素水平其他提取條件超聲時(shí)間10、20、30、40、50、60 min液料比20 mL ∶1 g，提取溫度50 ℃，提取1 h，提取2次液料比

5 mL ∶1 g、10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g超聲時(shí)間30 min，提取溫度50 ℃，提取1 h，提取2次

提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃超聲時(shí)間30 min，液料比20 mL ∶1 g，提取1 h，提取2次

以上試驗(yàn)均進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.3.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以超聲時(shí)間A、液料比B、提取溫度C為考察因素，以花色苷提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.5b軟件優(yōu)化藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝。試驗(yàn)因素水平編碼見表2。

表2Box-Behnken試驗(yàn)因素水平編碼

水平因素因素A：超聲時(shí)間

（min）B：液料比

（mL ∶g）C：提取溫度

（℃）-14020 ∶15005030 ∶16016040 ∶170

1.3.5藍(lán)莓酒渣花色苷抗氧化活性檢測[22-23]

1.3.5.1DPPH自由基清除能力測定配置0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL的藍(lán)莓酒渣花色苷溶液，各取2 mL于具塞試管中，每管加入2 mL 2×10-4 mol/L DPPH溶液，搖勻后避光放置30 min。以同濃度維生素C和25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，分別測定517 nm處的吸光度D517 nm。

DPPH·清除率=[1-（D517 nm（i）-D517 nm（j））/D517 nm（o）]×100%。

式中：D517 nm（i）、D517 nm（j）、D517 nm（o）分別為測定條件為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液、2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇、2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.5.2抗超氧陰離子自由基能力測定配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液，按試劑盒說明書操作，取同濃度維生素C溶液和25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液作對照，無水乙醇作空白對照。超氧陰離子自由基清除能力計(jì)算公式如下：

抗超氧陰離子活力單位（U/L）=（D550 nm（對照組）-D550 nm（試驗(yàn)組））/（D550 nm（對照組）-D550 nm（標(biāo)準(zhǔn)組））×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）×1 000 mL。

1.3.5.3清除羥自由基能力的測定分別取0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL樣品溶液，按試劑盒說明書操作，其呈色與OH·的多少成正比關(guān)系，即吸光度越小，樣品對羥自由基的清除能力越強(qiáng)。取同濃度維生素C溶液和25%藍(lán)莓花青素標(biāo)品溶液作陽性對照，以無水乙醇作空白對照。羥自由基抑制能力計(jì)算公式如下：

抑制率=（D對照組-D試驗(yàn)組）/D對照組×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1超聲時(shí)間對藍(lán)莓酒渣花色苷提取率的影響如圖1所示，隨超聲時(shí)間的延長，藍(lán)莓酒渣花色苷提取率逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間超過50 min以后，提取率基本趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)楫?dāng)時(shí)間達(dá)50 min時(shí)，在超聲作用下酒渣基本完全破壁，繼續(xù)延長超聲時(shí)間反而會(huì)使部分花色苷分解，因此，50 min 為適宜的超聲時(shí)間。

2.1.2液料比對藍(lán)莓酒渣花色苷提取率的影響如圖2 所示，在液料比30 mL ∶1 g以內(nèi)，隨液料比逐漸增大，花色苷提取率逐漸增加；當(dāng)液料比達(dá)30 mL ∶1 g后，繼續(xù)增大提取溶劑量，提取率增加極其緩慢。結(jié)果說明，增加溶劑量會(huì)增大花色苷擴(kuò)散速度，使提取速度加快，但過量的提取溶劑會(huì)導(dǎo)致物料吸收的超聲能減少、花色苷溶出不充分，而且過高溶劑量既增加了成本，又加重了后續(xù)濃縮負(fù)擔(dān)，因此綜合考慮可以確定 30 mL ∶1 g 為最佳液料比。

2.1.3提取溫度對藍(lán)莓酒渣花色苷提取率的影響如圖3所示，提取溫度低于60 ℃時(shí)，隨著提取溫度的增加，花色苷的提取率逐漸增大；60～70 ℃之間，花色苷提取率相對平穩(wěn)；超過70 ℃后，花色苷提取率反而下降。這是因?yàn)榛ㄉ盏娜芙舛葧?huì)隨溫度升高而提高，但溫度過高會(huì)使少部分花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得提取率下降，因此綜合比較可選60 ℃為藍(lán)莓酒渣花色苷適宜的提取溫度。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1回歸模型建立及方差分析采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，其中實(shí)測值為3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值。

應(yīng)用Design Expert8.0.5b軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸

表3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

序號A：超聲時(shí)

間（min）B：液料比

（mL ∶g）C：提取溫

度（℃）提取率（mg/g）實(shí)測值預(yù)測值10-115.8355.85201-15.9835.973-10-15.7955.84-1105.9325.9551016.1026.106-1015.9375.947-1-105.6545.6481-105.9235.9190006.0216.01100006.0326.01110005.9846.01120116.0756.061310-16.0186.02141106.0566.07150-1-15.7125.72

分析，得到以藍(lán)莓酒渣花色苷提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：

花色苷提取率（mg/g）=2.017 42+0.053 071A+0085 525B+0.037 237C-3.62 500×10-4AC-1.450 00×10-4AC-7.750 00×10-5BC-2.966 67×10-4A2-9.141 67×10-4B2-1.966 67×10-4C2。

式中：A為超聲時(shí)間，min；B為液料比，mL ∶g；C為提取溫度， ℃。

對模型進(jìn)行顯著性分析，由表4可知，回歸模型極顯著（P=0.000 2<0.01），失擬項(xiàng)（P=0.645 7）不顯著，實(shí)際試驗(yàn)值與預(yù)測值具有高度相關(guān)性（R2=0.989 8，R2Adj=0.971 5），表明模型與試驗(yàn)值擬合良好[24]，試驗(yàn)方法可信度高，試驗(yàn)得到的2次回歸方程能夠很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。由表4還可知，3個(gè)自變量對響應(yīng)值的影響程度大小依次為液料比（B）>超聲時(shí)間（A）>提取溫度（C），其中3個(gè)因素以及液料比的 2次項(xiàng)（B2）對花色苷提取量影響極顯著（P<0.01），超聲時(shí)間和料液比的交互作用（AB）對花色苷提取量影響顯著（P<0.05）。表4方差分析結(jié)果

參數(shù)平方和自由度均方F值P值顯著性模型0.246 366 01790.027 374 00254.036 522 820.000 2極顯著A：超聲時(shí)間0.076 245 12510.076 245 125150.508 554<0.000 1極顯著B：液料比0.106 260 510.106 260 5209.759 170 9<0.000 1極顯著C：提取溫度0.024 310 12510.024 310 12547.988 402 70.001 0極顯著AB0.005 256 2510.005 256 2510.375 8841 90.023 4顯著AC0.000 84110.000 8411.660 141 4710.254 0BC0.000 240 2510.000 240 250.474 255 6340.521 7A20.003 249 64110.003 249 6416.414 820 2510.052 4B20.030 856 64110.030 856 64160.911 283 490.000 6極顯著C20.001 428 10310.001 428 1032.8190871470.154 0殘差0.002 532 91750.000 506 583失擬項(xiàng)0.001 268 2530.000 422 750.668 555 6140.645 7不顯著純誤差0.001 264 66720.000 632 333總和0.248 898 93314R20.989 8R2Adj0.971 5

2.2.2響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化圖4至圖6反映了幾個(gè)因素間的交互作用對藍(lán)莓酒渣花色苷提取率的影響。響應(yīng)曲面圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對提取率的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較小；等高線圖反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[24]。由圖4可見，超聲時(shí)間與液料比交互作用的響應(yīng)面坡度陡，等高線密集，說明二者交互作用顯著；同一超聲時(shí)間下，隨液料比增加，提取率顯著增加；與之相比，在同一液料比水平下，隨著超聲時(shí)間的增加，提取率增加幅度較緩。由圖5、圖6看出，2個(gè)因素間交互作用的響應(yīng)面坡度緩，等高線稀疏，說明二者交互作用不顯著，這一結(jié)論與方差分析中3個(gè)自變量F值大小排序所反映的趨勢一致。

2.2.3最優(yōu)提取工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)通過軟件分析得到藍(lán)莓酒渣花色苷超聲輔助法最佳提取工藝為：超聲時(shí)間4996 min、液料比33.48 mL ∶1 g、提取溫度65.15 ℃，在此條件下，藍(lán)莓酒渣花色苷提取率可達(dá)6.110 95 mg/g。為了操作方便，修正最佳提取工藝條件為：超聲時(shí)間50 min、液料比 33 mL ∶1 g、提取溫度65 ℃。在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得提取率平均值為6.092 mg/g，實(shí)測值與預(yù)測值相對誤差僅為0.31%，說明該優(yōu)化設(shè)計(jì)方案可以較好地預(yù)測藍(lán)莓酒渣花色苷提取情況。

2.3藍(lán)莓酒渣花色苷抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除能力如圖7所示，隨著溶液濃度的增加，3種樣品清除DPPH自由基能力不斷增強(qiáng)，同濃度條件下，維生素C清除DPPH自由基能力高于25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品和藍(lán)莓酒渣花色苷。當(dāng)藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和藍(lán)莓酒渣花色苷溶液濃度為0.01～0.02 mg/mL時(shí)，前者對DPPH

自由基的清除率高于后者；隨濃度逐漸增大并大于 0.04 mg/mL 后，前者的清除率低于后者；當(dāng)藍(lán)莓酒渣花色苷溶液濃度達(dá)0.08mg/mL時(shí)，清除率達(dá)78.59%；濃度達(dá) 0.16 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)81.70%。

2.3.2抗超氧陰離子自由基能力由圖8可見，隨著溶液濃度的增加，3種樣品抗超氧陰離子自由基能力不斷增強(qiáng)；相同濃度條件下，維生素C抗自由基能力高于25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品和藍(lán)莓酒渣花色苷。25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品抗自由基能力在一定濃度內(nèi)略高于藍(lán)莓酒渣花色苷，當(dāng)藍(lán)莓酒渣花色苷溶液濃度達(dá)0.16 mg/mL時(shí)，抗自由基能力達(dá)220.89 U/L。

2.3.3羥自由基抑制能力如圖9所示，隨著3種樣品溶液濃度增加，羥自由基抑制率不斷提高。同濃度時(shí)抗維生素C對羥自由基的抑制能力大于25%藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品、藍(lán)莓酒渣花色苷。當(dāng)藍(lán)莓花色苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和藍(lán)莓酒渣花色苷溶液濃度為0.01～0.02 mg/mL時(shí)，前者自由基抑制率低于后者；隨濃度增大為0.04～0.16 mg/mL時(shí)，后者自由基清除率低于前者；當(dāng)藍(lán)莓酒渣花色苷濃度達(dá)0.08 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)66.54%；濃度達(dá)0.16 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)82.40%。

綜合分析以上3組試驗(yàn)結(jié)果可知，藍(lán)莓酒渣花色苷具有較好抗氧化能力，與25%藍(lán)莓花色素苷標(biāo)準(zhǔn)品抗氧化能力接近。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了藍(lán)莓酒渣花色苷最佳提取工藝，建立了可靠的預(yù)測模型，得到藍(lán)莓酒渣花色苷最優(yōu)提取條件為：檸檬酸酸化70%乙醇（體積含量，pH值=3）為提取液，浸泡10 min，液料比33 mL ∶1 g、超聲時(shí)間50 min、提取溫度65 ℃、連續(xù)提取2次。此條件下藍(lán)莓酒渣花色苷提取率為6.092 mg/g，與理論預(yù)測值基本一致。通過DPPH自由基清除能力、抗超氧自由基能力、羥自由基抑制能力測試發(fā)現(xiàn)，所提酒渣花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性，0.16 mg/mL 的花色苷提取液對DPPH自由基清除率達(dá)8170%，抗超氧陰離子自由基能力達(dá)220.89 U/L，羥自由基抑制率為82.40%。由此可見，超聲輔助提取的藍(lán)莓酒渣花色苷得率較高、抗氧化能力較強(qiáng)，既為節(jié)能環(huán)保、提高藍(lán)莓酒渣資源的利用率提供了很好的思路，又為藍(lán)莓酒渣花色苷工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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