李光偉， 苗宏志， 李 波， 王國忠， 金 莉， 林 巖， 鄧志會， 肖 微

(1齊齊哈爾醫(yī)學院病理生理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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鈣敏感受體通過G蛋白-PLC-IP3信號途徑調節(jié)肺動脈張力*

李光偉1△， 苗宏志2， 李 波1， 王國忠1， 金 莉1， 林 巖1， 鄧志會1， 肖 微1

(1齊齊哈爾醫(yī)學院病理生理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

目的： 探討鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在肺血管張力調節(jié)中的作用及信號途徑。方法: 采用Ⅱ型膠原酶消化法提取大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，激光共聚焦掃描顯微鏡技術觀察不同條件下PASMCs中鈣離子濃度的變化，組織浴槽血管環(huán)技術觀察血管張力的變化。結果: CaSR激動劑(鈣、釓)引起劑量依賴性的細胞內鈣增加和血管張力增大， U73122和D609(PLC抑制劑)以及2-APB和肝素(IP3受體抑制劑)可減弱CaSR的作用(P<0.05)，而U73343(U73122的無生物活性類似物)則無此作用(P>0.05)。結論: CaSR活化導致細胞內鈣增加，進而引起肺動脈環(huán)收縮，這些過程是通過G蛋白-PLC-IP3信號轉導通路實現(xiàn)的。

鈣敏感受體； 肺動脈張力； 細胞內鈣

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是細胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體，其活化后通過引起細胞內鈣離子濃度增加進而參與多種細胞活動，如細胞增殖、分化和凋亡等[1]。我們前期研究證實大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中有鈣敏感受體的表達，缺氧能夠活化肺動脈平滑肌細胞的CaSR，并促進其的增殖，進而參與缺氧性肺動脈高壓的發(fā)生[2-4]。肺動脈收縮和肺動脈平滑肌細胞重構是肺動脈高壓發(fā)生的兩大病理生理學基礎。CaSR在肺動脈張力的調節(jié)中是否其作用，國內外尚未見報道。本文就上述問題展開研究。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

U73122、U73343、2-APB、GdCl3、NiCl2、CdCl2、Fluo-3/AM及Ⅱ型膠原酶均購自Sigma。

解剖顯微鏡 (Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Leica)；ALC-M離體組織器官實驗系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 肺動脈分離和平滑肌細胞培養(yǎng) 肺動脈分離和平滑肌細胞提取、培養(yǎng)參照文獻[5]進行。在解剖顯微鏡下分離大鼠肺動脈，采用Ⅱ型膠原酶消化法提取原代平滑肌細胞，第3～5代生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

2.2 細胞內鈣離子濃度測定 細胞棄培養(yǎng)液，含鈣Krebs洗滌。Fluo-3/AM(5 μmol/L)37 ℃避光孵育40 min；去除負載液，含鈣Krebs洗滌，備用。用激光掃描共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測[Ca2+]i的變化，激發(fā)波長為488 nm[6]。

2.3 肺動脈環(huán)張力的測定 Wister大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(2 mg/kg)。開胸取心臟和肺臟，置于4 ℃盛有HEPES液的培養(yǎng)皿中，顯微解剖鏡下，游離直徑0.3～0.7 mm肺內肺動脈，除去血管周圍脂肪和結締組織，剪成長度約為3 mm血管環(huán)，懸掛在2根鎢絲三角環(huán)上，一端掛在塑料支架下面的鐵鉤上，置于盛有4 mL Krebs液恒溫浴槽內，另一端掛在張力換能器的電極上，持續(xù)通以95% O2-5% CO2混合氣。在30 min內逐漸給肺動脈環(huán)負荷0.3 g的基礎張力，平衡1 h后，分別測定不同條件下的血管張力[7]。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計學處理使用SPSS 17.0軟件進行。采用配對t檢驗方法判斷其差異顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 [Ca2+]O增加引起[Ca2+]i增加

如圖1所示，當[Ca2+]O從5 mmol/L增加到12.5 mmol/L時，PASMCs內熒光強度呈劑量依賴性增加，當[Ca2+]O達到10 mmol/L時，進入平臺期與基礎濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2 [Ca2+]O增加引起[Ca2+]i增加是通過CaSR活化所介導的

如圖2所示，10 mmol/L CaCl2引起[Ca2+]i增加(P<0.05)，在0.1 mmol/L NiCl2(鈉-鈣交換阻斷劑)和0.02 mmol/L CdCl2(L型鈣通道阻斷劑)預孵育組[Ca2+]iFI/FI0有所降低，但仍高于對照組(P<0.05)，10 μmol/L NPS2390(CaSR阻斷劑)預孵育組出現(xiàn)類似的變化。而NiCl2、CdCl2及NPS2390共同預孵育情況下，[Ca2+]iFI/FI0明顯降低，與control組比較無顯著差異(P>0.05)。

3 U73122、U73343、2-APB、D609及肝素(heparin)對CaSR 活化所致PASMCs [Ca2+]i變化的影響

10 μmol/L U73122(PLC抑制劑)及100 μmol/L D609(PLC抑制劑)預處理后，CaCl2引起[Ca2+]i增加的作用被明顯減弱(P<0.05)，而10 μmol/L U73343(無生物效應的U73122的類似物)預處理則沒有引起上述變化；另外75 μmol/L 2-APB(IP3抑制劑)及50 μmol/L肝素(IP3受體抑制劑)亦可明顯減弱CaCl2引起[Ca2+]i增加的作用(P<0.05)。300 μmol/L GdCl3能夠引起類似的反應，見圖3、4。

4 [Ca2+]O增加引起肺動脈環(huán)張力的變化

以0.3 g的基礎張力作為100%(control)。如圖5所示，細胞外Ca2+濃度在0.5～2.5 mmol/L時，肺動脈環(huán)不發(fā)生收縮，當細胞外Ca2+濃度升高到5～12.5 mmol/L時，出現(xiàn)了劑量依賴性的血管收縮(P<0.05)。在0.1 mmol/L NiCl2(鈉-鈣交換阻斷劑)和0.02 mmol/L CdCl2(L-型鈣通道阻斷劑)預孵育組肺動脈收縮有所降低，10 μmol/L NPS2390(CaSR阻斷劑)預孵育組出現(xiàn)類似的變化。而NiCl2、CdCl2及NPS2390共同預孵育情況下，肺動脈環(huán)收縮顯著降低。

5 U73122、U73343、2-APB、D609及肝素對CaSR 活化引起肺動脈環(huán)收縮的影響

U73122及D609預處理后，肺動脈環(huán)收縮作用明顯減弱(P<0.05)，U73343預處理則沒有引起上述變化；2-APB及肝素同樣引起肺動脈環(huán)收縮減弱(P<0.05)。GdCl3能夠引起類似的反應,見圖6、7。

討 論

肺動脈高壓發(fā)生的兩大病理生理學基礎是肺血管收縮和肺血管重構，我們前期研究證實CaSR可以促進缺氧性肺動脈平滑肌細胞增生進而可以促進肺動脈高壓的發(fā)生。然而，CaSR在肺血管收縮中是否起作用，國內外未見報道。

Figure 1.The effect of different extracellular calcium concentrations ([Ca2+]o) on the intracellular calcium concentrations ([Ca2+]i ) in the PASMCs.

CaSR是1993年新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體[1]。其激動劑為多價陽離子，如Ca2+、Gd3+及帶有芳香族側鏈的氨基酸[8]。文獻報道，Ca2+活化CaSR的EC50是3～4 mmol/L[9]。我們的實驗觀察到，[Ca2+]o在1.8～2.5 mmol/L并沒用引起細胞內鈣離子濃度的變化，當[Ca2+]o升高到5～12.5 mmol/L時，細胞內鈣離子的熒光強度以劑量依賴的形式增加。這就意味著在肺動脈平滑肌細胞CaSR活化能夠引起[Ca2+]i增加。另外，在NiCl2和CdCl2預處理的情況下，[Ca2+]i的熒光強度降低，但仍高于對照組，NPS2390預處理也可以使[Ca2+]i的熒光強度降低，而在NiCl2、CdCl2以及NPS2390共同存在時，[Ca2+]i的熒光強度明顯降低，與對照組無顯著差異。這些結果提示：CaSR和L型鈣通道及鈉鈣交換蛋白一起，共同參與了[Ca2+]o增加導致[Ca2+]i增加這一過程。

Figure 2.The effects of different inhibitors on the change of [Ca2+]i in the PASMCs induced by activated CaSR. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 3.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on the change of [Ca2+]i induced by CaCl2 in the PASMCs. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 4.The effects of U73122,U73343,D609,2-APB and heparin on the change of [Ca2+]i induced by GdCl3 in PASMCs. Mean±SD. n=20. *P<0.05 vs control.

Figure 5.The effects of different inhibitors on constriction of pulmonary artery ring induced by increased [Ca2+]o . Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control; ## P<0.01 vs CaCl2 .

Figure 6.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on constriction of pulmonic ring induced by CaCl2. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control.

Figure 7.The effects of U73122, U73343, D609, 2-APB and heparin on vasoconstriction of pulmonary artery ring induced by GdCl3. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control.

Wang等[10]證實細胞外鈣增加、Gd3+及精胺能夠引起大鼠心肌細胞肌漿網(wǎng)通過G蛋白-PLC-IP3信號轉導通路釋放Ca2+。我們發(fā)現(xiàn)，U73122和D609(PLC抑制劑)以及2-APB和肝素(IP3抑制劑)可以顯著減弱Ca2+及Gd3+誘導的細胞內鈣增加的作用，而U73122的無生物效應類似物U73343則對這種細胞內鈣增加則無顯著作用。此結果充分說明在肺動脈平滑肌細胞CaSR活化誘導的細胞內鈣增加是通過G蛋白-PLC-IP3信號轉導通路實現(xiàn)的。

我們知道，細胞內鈣作為興奮-收縮偶聯(lián)因子參與心肌收縮和血管張力的調節(jié)。Wonneberger等[11]發(fā)現(xiàn)，在沙土鼠的蝸旋動脈，細胞外鈣離子從1 mmol/L增加到10 mmol/L能夠引起細胞內鈣增加，并且可以相平行地引起血管收縮。在血管環(huán)實驗中，我們觀察到細胞外鈣離子濃度在5～12.5 mmol/L 時，肺動脈環(huán)出現(xiàn)了劑量依賴性的收縮，Gd3+可以引起類似的變化。另外，這種血管收縮可以被NiCl2、CdCl2及NPS2390的預處理所減弱，提示Gd3+和Ca2+誘導的血管收縮至少部分是通過CaSR引起的。

文獻報道，CaSR的細胞內信號轉導通路與胞漿鈣庫相關聯(lián)[12]。因此我們在測定血管張力時發(fā)現(xiàn)，Gd3+和Ca2+誘導的肺動脈收縮作用能夠被U73122、D609、2-APB及肝素所抵消，而U73343則無上述作用，進一步說明CaSR活化所誘導的肺動脈收縮是通過G-PLC-IP3信號轉導通路實現(xiàn)的。

上述實驗結果提示：CaSR活化引起細胞內鈣增加，進而導致肺動脈環(huán)收縮，這一過程是通過G蛋白-PLC-IP3信號轉導通路實現(xiàn)的。由于肺動脈收縮是缺氧性肺動脈高壓發(fā)生的潛在機制之一，因此CaSR可能成為防治肺動脈高壓的新靶點。

[1] Brown EM, Gamba G, Riccardi D,et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid[J]. Nature, 1993, 366(6455): 575-580.

[2] Li GW, Xing WJ, Bai SZ, et al. The calcium-sensing receptor mediates hypoxia-induced proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells through MEK1/ERK1,2 and PI3K pathways[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2011, 108(3):185-193.

[3] 李光偉，邢文婧，郝靜輝，等. 鈣敏感受體在缺氧誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(12):2433-2437.

[4] 李光偉，李 波，康美佳，等. 鈣敏感受體通過PI3K信號途徑介導缺氧誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖[J]. 中國病理生理雜志，2012, 28(9):1549-1553.

[5] Li YM, Li Q, Wang ZG, et al. 15-HETE suppresses K+channel activity and inhibits apoptosis in pulmonary artery smooth muscle cells[J]. Apoptosis, 2009, 14(1):42-51.

[6] 孫 健，于金鳳，欒海榮，等. 小鼠胚胎干細胞鈣敏感受體的表達和其對細胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(30):651-657.

[7] Chu XJ, Tang XB, Guo L, et al. Hypoxia suppresses KV1.5 channel expression through endogenous 15-HETE in rat pulmonary artery[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat，2009, 88(1-2):42-50.

[8] Handlogten ME, Shiraishi N, Awata H, et al. Extracellular Ca2+-sensing receptor is a promiscuous divalent cation sensor that responds to lead[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2000, 279(6):F1083-F1091.

[9] Zhang W, Xu C. Calcium sensing receptor and heart di-seases[J]. Pathophysiology, 2009,16(4): 317-323.

[10]Wang R,Xu C,Zhao W, et al. Calcium and polyamine regulated calcium-sensing receptors in cardiac tissues[J].Eur J Biochem, 2003, 270(12):2680-2688.

[11]Wonneberger K,Scofield MA,Wangemann P.Evidence for a calcium-sensing receptor in the vascular smooth muscle cells of the spiral modiolar artery[J].J Member Biol,2000,175(3):203-212.

[12]Treiman M, Caspersen C, Christensen SB. A tool coming of age: thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases[J]. Trends Pharmacol Sci, 1998, 19(4): 131-135.

Calcium-sensing receptor modulates pulmonary artery tension through G-protein-PLC-IP3pathways

LI Guang-wei1, MIAO Hong-zhi1, LI Bo1, WANG Guo-zhong1, JIN Li1, LIN Yan1, DENG Zhi-hui1, XIAO Wei1

(1DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheFirstHospitalofQiqiharCity,Qiqihar161005,China.E-mail:qiqihaerlgw@163.com)

AIM: To observe the role of calcium-sensing receptor (CaSR) in the regulation of pulmonary artery tension. METHODS: The intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) was detected by laser-scanning confocal microscopy, and the pulmonary artery tension was determined by the pulmonary arterial ring technique. RESULTS: Increased levels of [Ca2+]oor Gd3+(an agonist of CaSR) induced the increase in [Ca2+]iand pulmonary artery constriction in a concentration-dependent manner. Additionally, the effects of Ca2+and Gd3+were inhibited by U73122 and D609 (specific inhibitor of PLC), and 2-APB and heparin (specific antagonist of IP3receptor). However, U73343 (U73122 inactive analogue) did not take effect. CONCLUSION: CaSR may be involved in the regulation of pulmonary artery tension by increasing [Ca2+]ithrough G-protein-PLC-IP3pathway.

Calcium-sensing receptor; Pulmonary artery tension; Intracellular calcium

1000- 4718(2015)01- 0018- 05

2014- 07- 23

2014- 10- 30

黑龍江省教育廳資助項目(No. 12511618)

△通訊作者 Tel： 0452-2663161; E-mail: qiqihaerlgw@163.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.004