任穎鴿， 譚曉麗， 陳 靜， 張 靜， 杜永平， 張?jiān)缕肌?/p>

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 1全軍中醫(yī)內(nèi)科中心， 2兒科腦發(fā)育研究室，陜西 西安 710032)

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芍藥苷抑制大鼠小腦浦肯野細(xì)胞對(duì)急性缺氧的功能反應(yīng)*

任穎鴿1,2， 譚曉麗2， 陳 靜2， 張 靜2， 杜永平1△， 張?jiān)缕?△

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院1全軍中醫(yī)內(nèi)科中心，2兒科腦發(fā)育研究室，陜西 西安 710032)

目的： 研究芍藥苷(paeoniflorin，Pae)對(duì)大鼠小腦浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)急性缺氧電生理反應(yīng)的影響。方法: 采用全細(xì)胞膜片鉗記錄法，記錄大鼠小腦PCs膜電位、興奮性和平行纖維(parallel fibre，PF)-PC興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)，觀察急性缺氧和芍藥苷對(duì)上述電生理功能的影響。結(jié)果: 缺氧后PCs 首先表現(xiàn)為短暫的超極化，繼之以短暫的去極化和持續(xù)超極化，芍藥苷完全阻斷了PCs的缺氧性超極化，并使PCs缺氧性去極化的幅度減小，持續(xù)時(shí)間縮短；缺氧上調(diào)了PCs興奮性，芍藥苷對(duì)缺氧引起的PCs的高興奮性無顯著影響；急性缺氧引起了PF-PC EPSCs的長時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)；芍藥苷可部分逆轉(zhuǎn)缺氧引起的PF-PC EPSCs衰減。結(jié)論: 芍藥苷顯著減輕了大鼠小腦PCs的缺氧反應(yīng)，可能增強(qiáng)了PCs對(duì)急性缺氧的耐受性。

芍藥苷； 缺氧； 浦肯野細(xì)胞； 膜電位； 突觸傳遞

哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元對(duì)缺氧非常敏感，數(shù)分鐘缺氧即可改變神經(jīng)元的功能，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡。缺氧引起的神經(jīng)元功能改變主要包括細(xì)胞膜去極化和突觸傳遞衰減[1-2]。近幾十年來，缺氧損傷的機(jī)制已在海馬和皮層神經(jīng)元中得到廣泛的研究。然而，對(duì)缺氧高度敏感的小腦神經(jīng)元卻未受到足夠的關(guān)注[3]。小腦主神經(jīng)元浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)不僅接受來自苔狀纖維和爬行纖維(climbing fibre, CF)的興奮性輸入，而且接受來自中間神經(jīng)元的抑制性輸入[4]，因而是研究缺氧損傷和缺氧保護(hù)機(jī)制的理想模型。

芍藥苷(paeoniflorin，Pae)作為芍藥的重要活性成分，有良好的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。由于芍藥苷能夠迅速透過血腦屏障，因而具有治療神經(jīng)系統(tǒng)各種疾病的潛力。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能夠?qū)谷毖跻鸬呐d奮性氨基酸濃度升高[6]，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載[7]，而且能阻斷鈉離子通道[8]，激活腺苷A1受體[9]，從而發(fā)揮缺氧保護(hù)作用。然而，芍藥苷對(duì)小腦神經(jīng)元的缺氧性功能反應(yīng)有無影響尚不清楚。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠小腦PCs在急性缺氧時(shí)膜電位和突觸傳遞的變化，發(fā)現(xiàn)芍藥苷能顯著抑制PCs的缺氧反應(yīng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生7～10 d的SD大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 NaCl、KC1、NaH2PO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖、葡萄糖酸鉀、HEPES、EGTA、磷酸肌酸二鈉、Na2ATP、Na3GTP和KOH均購自Sigma；芍藥苷購自中國藥物檢定所。

1.3 溶液 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L)：NaCl 126.0，KCl 5.0，NaH2PO4·H2O 1.25，MgSO4·7H2O 2.0，CaCl2·2H2O 2.0，NaHCO326.0，葡萄糖10.0，pH 7.35～7.45，滲透壓310～320 mOsm/L。電極內(nèi)液成分(mmoL/L)：葡萄糖酸鉀 120.0，KC1 5.0，HEPES 10.0，EGTA 5.0，CaCl2·2H2O 0.5，MgSO4·7 H2O 2.0，磷酸肌酸二鈉 2.0，Na2ATP 4.0，Na3GTP 0.3，用濃度為0.5 mol/L的KOH調(diào)pH為7.35～7.45，滲透壓285～300 mOsm/L。

1.4 儀器 振動(dòng)切片機(jī)(Leica)，正置顯微鏡(Zeiss)，微電極操縱儀(Sutter Instrument)，放大器(Axon Instrument)，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Axon Instruments)，電極拉制儀(Sutter Instrument)，刺激器(CYGNUS)，滲透壓測定儀(FISKE Associate)，恒流泵(上海滬西儀器廠)。

2 方法

2.1 腦片制備 取SD幼鼠小腦，放入充95% O2、5% CO2混合氣的0 ℃ ACSF中，約1 min后取出，修整后移入切片槽內(nèi)固定，用振動(dòng)切片機(jī)切出300 μm厚的腦片，立即轉(zhuǎn)移至32 ℃的ACSF中孵育約30 min，移至室溫下繼續(xù)孵育1 h后開始記錄。整個(gè)過程通以95% O2、5% CO2混合氣體。實(shí)驗(yàn)操作及內(nèi)容符合西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的規(guī)定。2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將腦片移至記錄浴槽內(nèi)，先在低倍鏡下確定小腦皮層的細(xì)胞層，然后在高倍鏡下選擇表面光滑、輪廓清晰、立體感強(qiáng)的PCs進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。玻璃微電極充灌內(nèi)液后電阻為7～9 MΩ，電壓鉗狀態(tài)下鉗制電壓為-70 mV。記錄過程中使用恒流泵持續(xù)向記錄浴槽內(nèi)灌注含95% O2、5% CO2混合氣體的ACSF，流速為2 mL/min。在保持膜電位為-60 mV左右的電流鉗狀態(tài)下，通過向細(xì)胞內(nèi)注射去極化電流(-50～300 pA，300 ms)誘發(fā)記錄細(xì)胞的動(dòng)作電位。將充有ACSF的玻璃微電極刺激小腦腦片的分子層，通過刺激器給予方波刺激(波寬0.1 ms，強(qiáng)度20～50 μA)，則可在PCs上記錄到平行纖維(parallel fibre，PF)興奮引起的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)。所有記錄在室溫(20～25 ℃)下進(jìn)行。

2.3 缺氧處理和藥物干預(yù) 穩(wěn)定記錄3 min后，將充以95% O2、5% CO2的ACSF轉(zhuǎn)換為充95% N2、5% CO2混合氣的ACSF灌流腦片2 min進(jìn)行急性缺氧處理，2 min后再轉(zhuǎn)換為正常灌流液。進(jìn)行藥物干預(yù)時(shí)，在充95% N2、5% CO2混合氣的ACSF加入芍藥苷(300 μmol/L)。研究表明芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用存在明顯的量效關(guān)系[5]，300 μmol/L是最佳作用劑量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采集使用pCLAMP軟件，數(shù)據(jù)測量使用Clampfit軟件。數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 8.0分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芍藥苷對(duì)急性缺氧大鼠小腦PCs膜電位的影響

在電流鉗模式下，記錄PCs的膜電位。共記錄78個(gè)PCs，平均靜息膜電位為(-58.6±10.1) mV。缺氧首先使PCs表現(xiàn)為短暫的早期超極化，緊接著一個(gè)短暫的較大的去極化和穩(wěn)定的缺氧后超極化，缺氧后超極化伴隨自發(fā)放電頻率增加，可持續(xù)30 min以上。早期超極化的時(shí)程為(0.47±0.14) min，去極化時(shí)程為(2.46±0.50) min。從缺氧處理開始到缺氧反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間延遲為0.69 min。

為了研究芍藥苷對(duì)PCs膜電位缺氧性變化的影響，在缺氧灌流液中加入芍藥苷(300 μmol/L)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCs膜電位僅表現(xiàn)為短暫的去極化[ΔV=(18.8±2.8) mV，去極化時(shí)程為(1.84±0.35) min]，復(fù)氧后膜電位恢復(fù)到靜息膜電位。與單純?nèi)毖跸啾?，去極化時(shí)間顯著縮短(P<0.05)，去極化的幅度顯著減小(P<0.05)。早期超極化和缺氧后超極化均未出現(xiàn)。此外，芍藥苷使缺氧反應(yīng)的延遲增加到1.2 min，與單純?nèi)毖跸啾扔酗@著差異(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1.The effects of Pae on the hypoxia-induced changes in membrane potential.

圖1 芍藥苷對(duì)缺氧引起的PCs膜電位變化的影響

表1 芍藥苷對(duì)缺氧引起的PCs膜電位變化的影響

R: resting potential; H: hypoxia hyperpolarization; D: depolarization; PH: post-hypoxia hyperpolarization.*P<0.05vshypoxia.

2 芍藥苷對(duì)急性缺氧大鼠小腦PCs興奮性的影響

電流鉗模式下，細(xì)胞被鉗制在-60 mV左右，細(xì)胞內(nèi)注射去極化電流誘發(fā)PCs動(dòng)作電位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧使PCs動(dòng)作電位的閾值由(102.8±20.5) pA 降低到(77.1±12.3) pA(P<0.01)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺氧后誘發(fā)動(dòng)作電位的頻率增高(P<0.05)。表明缺氧上調(diào)了PCs的興奮性，見圖2。

缺氧灌流液中加入芍藥苷，仍然使PCs的動(dòng)作電位閾值降低(P<0.01)，誘發(fā)動(dòng)作電位的頻率增高(P<0.05)，表明芍藥苷并沒有改變?nèi)毖跻鸬腜Cs高興奮性，見圖2。

Figure 2.The effects of Pae on the hypoxic changes of PC excitability. A: an example of a PC spikes in response to depolarizing current step (60 pA) before and after 2 min of hypoxic insult; B: pooled data of 9 PCs show that the spike frequency increased after hypoxic insult; C: the threshold of spikes was decreased significantly by hypoxic insult in rat PCs; D: an example of a PC spikes in response to depolarizing current step (60 pA) before and after hypoxia episode with Pae treatment; E: pooled data of 6 PCs show that the spike frequency increased after hypoxic insult with the presence of Pae; F: the threshold of spikes was still decreased by hypoxic insult with the presence of Pae in rat PCs. Mean±SD.n=9 in B and C;n=6 in E and F.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖2 芍藥苷對(duì)缺氧引起的PCs興奮性變化的影響

3 芍藥苷對(duì)急性缺氧大鼠小腦PF-PC突觸傳遞的影響

急性缺氧使大鼠小腦PF-PC突觸傳遞迅速抑制，PF-PC EPSCs的曲線下面積(area under the curve，AUC)降低到缺氧前的(43.0±4.9)%(P<0.01)并持續(xù)30 min以上，即LTD。若缺氧的同時(shí)給予芍藥苷，PF-PC EPSCs的AUC僅降低到缺氧前的(65.0±7.6)%(P<0.01)，與單純?nèi)毖跻鸬腅PSCs AUC相比，差異顯著(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of Pae on the hypoxia-induced changes in PF-PC EPSCs. Insets are averaged PF-PC EPSCs from 6 sweeps taken before and after hypoxia. A,C: the first 10 min of the record; B,D: the last 10 min of the record.**P<0.01vsA;##P<0.01vsC;△P<0.05vsB.

圖3 芍藥苷對(duì)缺氧引起的PF-PC EPSC變化的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)急性缺氧引起了大鼠PCs膜電位的3相變化，首先表現(xiàn)為短暫的缺氧性超極化，隨后是較大的去極化，接著又是缺氧后超極化。缺氧引起的PCs膜超極化和去極化均較在其它腦區(qū)神經(jīng)元觀察到的超極化或去極化的幅度大[10]。這一現(xiàn)象表明小腦PCs對(duì)缺氧的敏感性更高。在海馬神經(jīng)元的研究顯示缺氧時(shí)由于能量代謝障礙導(dǎo)致ATP水平降低，激活A(yù)TP敏感的鉀離子通道引起鉀離子外流，以及腺苷釋放增多而激活腺苷A1受體，是引起缺氧性超極化的主要機(jī)制[11]。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能夠激活腺苷A1受體[9]，提示芍藥苷有可能通過神經(jīng)元超極化而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示芍藥苷阻斷了缺氧引起的PCs早期超極化和缺氧后超極化，提示在小腦主神經(jīng)元PCs中，芍藥苷不是通過超極化機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。而芍藥苷在小腦環(huán)路的神經(jīng)保護(hù)作用與腺苷A1受體激活是否相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

缺氧性去極化被認(rèn)為是神經(jīng)元缺氧性損傷的觸發(fā)機(jī)制。本研究中，芍藥苷抑制了PCs缺氧性去極化的幅度和時(shí)程，并延長了PCs膜電位缺氧性反應(yīng)的潛伏期，表明芍藥苷的存在增強(qiáng)了PCs的缺氧耐受性。有研究表明芍藥苷能對(duì)抗缺氧引起的興奮性氨基酸過度釋放[6]，阻斷鈉離子通道[8]，這可能與芍藥苷抑制了PCs缺氧性去極化有關(guān)。

關(guān)于缺氧后神經(jīng)元興奮性的改變文獻(xiàn)報(bào)道不一致。Doolette等[12]報(bào)道缺氧后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元興奮性增高，Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)缺氧并沒有改變CA1區(qū)神經(jīng)元的興奮性。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧上調(diào)了PCs的興奮性。芍藥苷雖然部分抑制了PCs的去極化，卻未改變PCs的缺氧性高興奮性。一般認(rèn)為神經(jīng)元缺氧狀態(tài)下興奮性增高會(huì)加速能量消耗，是導(dǎo)致缺氧損傷的重要機(jī)制[10]。然而，在小腦神經(jīng)元環(huán)路中，如果PCs興奮性降低，PCs對(duì)小腦深部核團(tuán)的傳出細(xì)胞的抑制將會(huì)減弱，小腦傳出到其它腦區(qū)的信號(hào)則會(huì)隨之增強(qiáng)。所以，我們認(rèn)為，缺氧引起的PCs高興奮性應(yīng)該是小腦環(huán)路的代償性保護(hù)機(jī)制之一，目的是有效抑制傳出細(xì)胞的興奮性輸出。以往的研究已從多方面證實(shí)芍藥苷有抑制神經(jīng)元缺氧性高興奮性的作用[5-8]，因此，我們的研究結(jié)果提示芍藥苷對(duì)神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)可能受不同神經(jīng)元環(huán)路的影響：芍藥苷可能容易對(duì)那些釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生抑制，而對(duì)于釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元的興奮性卻沒有明顯的抑制作用。芍藥苷阻斷PCs的缺氧性超極化，不影響PCs的缺氧性高興奮性，正是一種通過維持PCs興奮性，從而維持全腦抑制水平的一種神經(jīng)環(huán)路保護(hù)機(jī)制。

缺氧可引起谷氨酸能突觸傳遞的迅速抑制[14]，這種抑制在多個(gè)腦區(qū)均是可逆的，甚至表現(xiàn)為缺氧后增強(qiáng)[15]。許多研究表明缺氧引起的突觸傳遞抑制與腺苷A1受體激活有關(guān)[15]。而在小腦腦片的研究顯示對(duì)腺苷不敏感的PF-PC突觸也同樣表達(dá)缺氧性抑制。本研究中，缺氧迅速引起了PF-PC LTD，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但這種抑制不因復(fù)氧而恢復(fù)，更未顯示缺氧后增強(qiáng)現(xiàn)象。雖然神經(jīng)元突觸傳遞的缺氧性抑制被認(rèn)為是一種保護(hù)機(jī)制，然而，PF-PC的突觸傳遞的抑制，可能導(dǎo)致PC-小腦深核傳出細(xì)胞的突觸傳遞的衰減，不利于小腦環(huán)路輸出信息的穩(wěn)定。芍藥苷顯著抑制了PF-PC突觸傳遞的缺氧性衰減，表明芍藥苷能部分挽救缺氧后PF-PC突觸的功能狀態(tài)，有利于小腦環(huán)路輸出信息的穩(wěn)定，這可能是芍藥苷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的一個(gè)重要機(jī)制。然而，芍藥苷是否對(duì)缺氧時(shí)CF-PC突觸傳遞和抑制性突觸傳遞有影響，有待我們的進(jìn)一步研究。

綜上所述，缺氧可引起PCs膜電位的3相型改變，使PCs興奮性增高，迅速抑制PF-PC突觸傳遞。芍藥苷能夠完全阻斷PCs的缺氧性超極化，部分抑制PCs去極化，部分逆轉(zhuǎn)缺氧引起的PF-PC突觸傳遞衰減。我們認(rèn)為芍藥苷對(duì)PCs缺氧性功能反應(yīng)的抑制有利于維持小腦環(huán)路的穩(wěn)定輸出，從而具有神經(jīng)保護(hù)意義。

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Paeoniflorin inhibits functional responses of rat cerebellar Purkinje cells to acute hypoxia insult

REN Ying-ge1, 2, TAN Xiao-li2, CHEN Jing2, ZHANG Jing2, DU Yong-ping1, ZHANG Yue-ping2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,2LaboratoryofBrainDevelopment,DepartmentofPediatrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;ddyypp@fmmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of paeoniflorin (Pae) on the functional responses induced by acute hypoxic insult in the rat cerebellar Purkinje cells (PCs). METHODS: The whole-cell patch clamp was used for the intracellular recording of PCs in the rat cerebellar slices to evaluate the changes of membrane potential, the excitability of PCs, and the parallel fibre (PF)-PC excitatory postsynaptic currents (EPSCs) upon acute hypoxic insult alone or with the pre-sence of Pae. RESULTS: PCs showed an initial hyperpolarization followed by brief depolarization and long lasting post-hypoxia hyperpolarization after hypoxia exposure. Pae completely blocked hypoxia-induced hyperpolarization and decreased the amplitude and the duration of hypoxic depolarization. Hypoxia up-regulated the excitability of rat PCs. Pae didn’t show any significant effect on the hypoxia-induced hyperexcitability in PCs. Acute hypoxia induced long-term depression (LTD) in rat cerebellar PF-PC EPSCs, and Pae partially reversed hypoxia-induced depression in PF-PC EPSCs. CONCLUSION: Pae significantly suppresses hypoxia-induced responses in rat PCs and probably increases the tolerance of rat PCs to acute hypoxia.

Paeoniflorin; Hypoxia; Purkinje cells; Membrane potential; Synaptic transmission

1000- 4718(2015)04- 0664- 05

2014- 12- 15

2015- 03- 12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30871029)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院助推計(jì)劃(No. XJZT10T07)

R363; R338.8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.016

△通訊作者 張?jiān)缕?Tel: 029-84773367; E-mail: ypzhang @fmmu.edu.cn； 杜永平 Tel: 029-84771307; E-mail: ddyypp@fmmu.edu.cn