王 鳳 張 萍 段文元 俞立瑋 趙健元 桂永浩

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·論著·

TBX2 基因3′非翻譯區(qū)位點rs59382073與漢族人群散發(fā)型先天性心臟病的易感性密切相關

王 鳳1張 萍1段文元2俞立瑋1趙健元3桂永浩1

目的 分析TBX2基因3′UTR變異位點與漢族人群散發(fā)型先天性心臟病(CHD)的遺傳易感性是否關聯，初步探討其可能的發(fā)病機制。方法納入2010年8月至2012年4月山東濟南軍區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所診斷的非綜合征型漢族CHD為CHD組，以同期醫(yī)院和社區(qū)體檢的健康兒童為對照組。選擇CHD組和對照組各24例行TBX2 3′UTR測序。根據測序結果在CHD組和對照組分別行SNaPshot基因分型和關聯分析；通過細胞轉染及熒光素酶檢測對陽性位點進行功能分析。結果CHD組納入768例，年齡(6.1±4.8)歲, 男383例(49.9%)；對照組納入660例，年齡(6.5±3.2)歲, 男354例(53.6%)。①24例CHD和24例對照行TBX2 基因3′UTR 區(qū)測序發(fā)現3個已知的SNPs位點：rs59382073、rs1058004和rs729782，未檢出新發(fā)SNPs位點。②樣本采集中期CHD和對照組各288例樣本的關聯分析顯示，rs59382073的基因型在CHD組和對照組的分布差異有統計學意義(P=0.012)；余2 個SNPs 在兩組間差異無統計學意義(P>0.5)，后續(xù)樣本未行該2個SNPs檢測。③全樣本關聯分析顯示，TBX2 3′UTR rs59382073位點與散發(fā)型CHD的患病風險密切相關，GT/TT基因型較GG基因型可導致CHD的患病風險增加2.13倍(OR=2.13, 95%CI：1.51～2.99,P=1.44×10-5)；進一步分層分析顯示，與GG基因型相比，GT/TT基因型增加2.75倍圓椎動脈干畸形(OR = 2.75, 95%CI :1.57～4.81，P=3.99×10-4)、3.18倍法洛四聯癥(OR=3.18, 95%CI:1.53～6.61，P=1.90×10-3)和1.70倍室間隔缺損(OR=1.70, 95%CI:1.17～2.46，P=5.14×10-3)的患病風險。④細胞水平的功能研究提示，與G等位基因相比，轉染T 等位基因可分別導致HEK 293 T及H9C2細胞的熒光素酶活性下降29.2%和33.6%。結論TBX2 3′UTR rs59382073 位點可顯著增加漢族人群散發(fā)型CHD的患病風險；其不同等位基因的熒光素酶表達水平存在差異，為潛在的功能位點。

先天性心臟??；TBX2基因； 單核苷酸多態(tài)性； 3′非翻譯區(qū)

TBX2基因是T-box轉錄因子基因家族的成員之一，表達于胚胎發(fā)生中的多個組織和器官。在鼠和雞胚的心臟發(fā)育中，表達于流出道、內彎、房室管和流入道的心肌，與非腔室分化的心肌帶相符[1～4]。作為潛在的轉錄抑制因子，Tbx2主要限制腔室特異性基因的表達，維持正常的心腔分化[1]。房室心肌Tbx2過表達導致心膠質和心內膜墊的異位，心肌保持原始狀態(tài)，線性心管無法環(huán)化，腔室分化受阻[5]，而Tbx2純合缺失的小鼠出現房室管和流出道的畸形[6]，提示其對于胚胎心臟的正常發(fā)育非常重要。

先天性心臟病(CHD)在活產嬰兒中的發(fā)病率為6‰～10‰[7]，但對其發(fā)生機制的理解仍然很局限。研究顯示，Tbx2 在心臟發(fā)育中的重要作用具有劑量敏感性[1]，其表達量的改變可能引發(fā)心臟畸形。然而，目前關于TBX2基因突變或表達異常引起CHD的研究較少，僅有的數據集中于17q23.1q23.2重復微缺失[8]、17q23.2重復(包含TBX2全基因)[9]以及啟動子區(qū)突變[10]，而對于同樣調控基因表達量的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)變異未見報道。為此，本研究擬通過較大樣本量的CHD病例-對照研究，分析TBX2 3′UTR單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分布與CHD發(fā)病風險的相關性，并嘗試初探其可能的作用機制。

1 方法

1.1 倫理 本研究經復旦大學附屬兒科醫(yī)院倫理委員會批準，流行病學調查資料收集及血樣采集均經研究對象知情同意。

1.2 CHD組納入標準 ①濟南軍區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所診斷的漢族兒童CHD連續(xù)病例；②CHD經彩色多普勒超聲心動圖或心導管檢查診斷，或外科手術證實。

1.3 CHD組排除標準 ①家族中有CHD患者；②合并心血管系統以外的畸形，如唐氏綜合征、Holt-Oram綜合征、Alagille綜合征、DiGeorge綜合征、William綜合征和Noonan綜合征等；③合并腫瘤等全身性疾?。虎芑純杭议L拒絕參與研究。

1.4 對照組納入和排除標準 ①濟南軍區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所就診的健康兒童，濟南軍區(qū)總醫(yī)院在濟南市15所小學常規(guī)進行健康體檢的兒童；②漢族；③性別和年齡與CHD組盡量匹配；④排除患遺傳性疾病和CHD等出生缺陷者。

1.5 血標本的采集 CHD組為病例診斷時臨床必須的采血；對照組為健康體檢時臨床檢測的剩余血樣。

1.6 位點初篩和分型預篩

1.6.1 位點預篩 為避免遺漏新發(fā)SNPs位點及確認本研究樣本存在的位點，SNPs定義為最小等位基因頻率(MAF)>1%的位點，即若需至少發(fā)現1例存在相應位點，則兩組共需48例(1/96，>1%)，故選擇CHD組和對照組各24例對TBX2 基因3′UTR 區(qū)行測序。

1.6.2 分型初篩 在樣本采集的中期，對收集到的CHD組和對照組樣本采用SNaPshot技術行基因分型預篩。對各基因型差異無統計學意義(P>0.5)的位點，后續(xù)收集的樣本不再進行基因分析檢測。為確認SNaPshot技術基因分型的準確性，選擇20%的樣本行測序驗證，鑒定兩種方法檢測基因型的一致率。

1.7 基因分型

1.7.1 PCR產物純化 取多重PCR擴增產物，加入TAKARA公司的ExoⅠ和SAP酶，按照說明提供的反應體系進行產物純化。

1.7.2 延伸反應 依據測序結果獲得相應位點信息，按表1設計延伸引物，取純化產物，采用美國ABI公司的SNaPshot試劑盒行延伸反應。

1.7.3 基因分型 獲得延伸產物后再次行產物純化，取1 μL產物由ABI 3130分析儀毛細管電泳分析，應用Peak Scanner軟件分析數據。

1.8 熒光素酶表達檢測 為明確陽性位點是否為潛在的功能位點，采用細胞實驗檢測野生型和突變型重組載體轉染對于外源熒光素酶表達量的影響，實驗重復3次。

1.8.1 細胞培養(yǎng) 采用的大鼠心肌細胞(H9C2)購自中科院上海細胞庫，HEK-293T 細胞為本實驗室所有。采用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均添加10% 胎牛血清，含青霉素100 U·mL-1、鏈霉素50 μg·mL-1，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。

表1 基因分型和質粒構建所用引物的DNA序列Tab 1 DNA sequence of all used primers

1.8.2 質粒構建 擴增目的片段，選擇Promega公司的psiCHECKTM-2質粒多克隆位點的XhoⅠ和NotⅠ作為酶切插入位點進行野生型載體構建并測序驗證。設計定點誘變引物(表1)，以構建好的野生型重組載體為模板，使用TOYOBO公司的KOD-Plus酶進行質粒誘變，構建突變型載體，并測序鑒定。

1.8.3 細胞轉染 細胞按相應密度接種于24孔板，每孔(0.5～2)×105個細胞，鋪板后18～24 h進行細胞轉染。采用Life Technologies公司的脂質體Lipofectamine 2000和Gibco公司的Opti-MEM培養(yǎng)液、取熒光素酶重組報告載體100 ng進行細胞轉染。轉染后4～6 h換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8.4 熒光素酶檢測 轉染24 h后收集細胞。采用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒，參照GloMax96 Microplate Luminometer 熒光檢測儀使用說明，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 一般情況 2010年8月至2012年4月CHD組納入768例，男383例(49.9%)，年齡(6.1±4.8)歲；對照組納入660例，男354例(53.6%)，年齡(6.5±3.2)歲，兩組性別構成和年齡差異均無統計學意義(P分別為0.09和0.06)。

CHD組參照Botto等[11]標準行CHD分型，包括間隔缺損520例(67.7%)、圓椎動脈干畸形97 例(12.6%)、右室流出道梗阻(RVOTO)26例(3.4%)、左室流出道梗阻(LVOTO)16例(2.1%)、肺靜脈異位回流(APVR)13例(1.7%)、復雜CHD 13例(1.7%)、房室間隔缺損(AVSD)11例(1.4%)和其他72例(9.4%，如PDA等)。具體CHD表型中室間隔缺損(VSD)396例(51.6%)，房間隔缺損45例(5.9%)和法洛四聯癥45例(5.9%)。

2.2TBX2 基因3′UTR區(qū)SNPs的鑒定 CHD和對照組各24例行TBX2 基因3′UTR 區(qū)測序發(fā)現3個已知的SNPs位點：rs59382073(圖1A)、rs1058004(圖1B)和rs729782(圖1C)，未檢出新發(fā)SNPs位點。

2.3TBX2 基因3′UTR 區(qū)候選SNPs 的初篩 在樣本采集的中期，CHD組和對照組各288 例采用SNaPshot 基因分型技術對上述3 個SNPs 行初步的關聯分析?；蚍中团c測序鑒定基因型的一致率達100%。3個位點的分型成功率分別為98.6%(rs59382073)、96.5%(rs1058004)和97.0%(rs729782)。結果顯示，rs59382073基因型在CHD組和對照組的分布差異有統計學意義[GG型：264/283(93.3%)vs248/285(87.0%); GT型：19/283(6.7%)vs37/285(13.0%)；P=0.012]，該位點位于3′UTR 終止密碼子后第218 位。表2顯示，余2 個SNPs 在兩組間差異無統計學意義(P>0.5)，后續(xù)樣本未行該2個SNPs檢測。3個位點在對照組中的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)。

圖1TBX2 3′UTR鑒定出的3個SNPs測序圖

Fig 1 Sequencing results of the three identified SNPs inTBX2 3′UTR

Notes A: rs59382073; B: rs1058004; C: rs729782

表2 TBX2 3′UTR鑒定的3個SNPs在CHD和對照組的基因型分布[n/N(%)]Tab 2 Genotype frequency of TBX2 3′UTR SNPs in CHD patients and controls[n/N(%)]

NotesPvalue of Hardy-Weinberg equilibrium in control group；In logistic regression analysis, dependent factors 1 and 0 denoted CHD group and control group, respectively

2.4 rs59382073位點與CHD的風險相關性分析 32例樣本因未獲得PCR產物而無法分型，故CHD組748/768例和對照組648/660例行基因分型?？紤]到中期分期樣本中未檢出rs59382073 位點TT型，CHD風險關聯分析時合并GT和TT型的數據。Logistic回歸結果顯示(表2)，與野生型GG 基因型相比，攜帶TBX2 3′UTR rs59382073位點的GT/TT基因型增加2.13倍CHD的患病風險(OR = 2.13, 95%CI ：1.51～2.99,P=1.44×10-5)，T等位基因較G等位基因增加2.24倍的CHD患病風險(OR=2.24, 95%CI：1.56～3.22，P=1.36×10-5)。

進一步按CHD 類型行分層分析(表3)，與GG基因型相比，攜帶GT/TT型者圓錐動脈干畸形的發(fā)病風險增加2.75倍(OR=2.75, 95%CI ：1.57～4.81，P=3.99×10-4)，VSD類型CHD患病風險增加1.70 倍(95%CI:1.17～2.46,P=5.14×10-3)，法洛四聯癥的發(fā)病風險增加3.18倍(95%CI：1.53～6.61，P=1.90×10-3)。

表3 rs59382073位點與各類CHD關聯的分層分析Tab 3 Stratified analysis of rs59382073 with CHD classification

Notes LVOTO: left ventricular outfow tract obstruction; RVOTO: right ventricular outfow tract obstruction; APVR: anomalous pulmonary venous return. The GG and GT/TT in control group were 594/648 and 54/648, respectively

2.5 rs59382073位點熒光素酶的表達 熒光素酶的表達檢測結果顯示，在HEK 293T細胞系psiCHECK基線、psiCHECK-T、psiCHECK2-G載體的熒光素酶表達量分別為(1.82±0.05)、(2.38±0.11)和(3.36±0.22)；在H9C2細胞系分別為(12.8±1.80)、(16.9±2.0)和(25.5±4.13)；psiCHECK-T 載體的熒光素酶表達量均顯著低于psiCHECK2-G 載體(P<0.05)。

3 討論

本研究CHD組768例，對照組660例，是CHD遺傳易感性研究中樣本量較大的單一地區(qū)和單一民族研究。本研究通過漢族人群CHD病例對照設計，首次發(fā)現TBX2基因3′UTR 區(qū)SNPs位點rs59382073與CHD的發(fā)病風險顯著相關，其中T等位基因為風險因子，增加了2.24倍的CHD患病風險(OR=2.24, 95% CI：1.56～3.22)。

TBX2基因定位于染色體17q23，包含7個外顯子[12, 13]，其對于維持胚胎心臟的正常發(fā)生必不可少。Tbx2缺失的小鼠呈現流出道間隔缺損，且腔室特異基因的表達擴展至房室管區(qū)域[6]；Tbx2缺陷的斑馬魚則出現多種心臟表型，包括心室發(fā)育不良、心房擴張、房室管和瓣膜異常，以及心率緩慢、心律不齊、心臟停搏和血液反流等，提示Tbx2對腔室的分化和房室管的形成有重要的意義[14]。本研究顯示，rs59382073 主要與圓錐動脈干畸形尤其是法洛四聯癥的發(fā)病風險顯著相關，這與小鼠胚胎Tbx2缺失引起的流出道畸形相一致[6]。本研究還發(fā)現，GT/TT基因型較GG基因型者的VSD患病風險增加了1.70 倍 。 Pang等[10]在

VSD患兒中發(fā)現了TBX2基因啟動子區(qū)DNA突變，提示TBX2非編碼區(qū)遺傳變異對于VSD的發(fā)生存在一定的作用。

Tbx2 在心臟發(fā)育中的重要作用呈現劑量依賴性[1]。Tbx2不僅可直接結合Anf、Cx40的啟動子區(qū)并調控其表達[1, 6]，還可通過與Nkx2-5、Gata4、Msx1、Msx2結合并抑制相應下游基因的表達[2, 15]。此外，Tbx2可調控細胞周期相關基因p19(ARF)和p21(CIP1)的表達水平[16, 17]。同時，Tbx2受Tbx20、視磺酸及BNP2等因子的調控[18～21]。本研究為確定rs59382073位點是否具有潛在的功能，檢測了G和T等位基因對于細胞轉染后熒光素酶表達量的影響。結果顯示，T等位基因在HEK 293T和H9C2兩種細胞系中均可顯著下調熒光素酶的活性, 表明TBX2 3′UTR rs59382073位點對于基因的表達量有著顯著的影響。因此，推測攜帶T等位基因者可能由于TBX2的表達不足而增加CHD的發(fā)病風險。

本研究的不足之處：需要在不同地區(qū)、不同民族人群中進一步擴大樣本量進行相關的病例對照研究；需要在CHD胚胎早期心臟組織中檢測不同基因型樣本TBX2基因mRNA和蛋白質的表達水平以進一步驗證研究結果。

結論：本研究首次發(fā)現了在漢族人群TBX2 3′UTR位點rs59382073與CHD的發(fā)病關聯，為完整闡述TBX2 對CHD 產生的遺傳效應提供理論支持，對于臨床檢測亦具有一定的指導意義，在CHD 的基因診斷方面具有潛在的應用價值。

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(本文編輯：丁俊杰)

A variant in TBX2 3′UTR, rs59382073, is significantly associated with susceptibility of sporadic congenital heart disease in Chinese Han population

WANGFeng1,ZHANGPing1,DUANWen-yuan2,YULi-wei1,ZHAOJian-yuan3,GUIYong-hao1

(1CadiovascularCenter,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 2InstituteofCardiovascularDiseaseGeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan250022; 3SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China)

GUI Yong-hao，E-mail:yhgui@shmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the association betweenTBX2 3′UTR variants and the susceptibility of sporadic congenital heart disease (CHD) in Chinese Han population and to reveal the possible mechanism.MethodsPatients with non-syndromic CHD diagnosed in Institute of Cardiovascular Disease, General Hospital of Ji′nan Military Region from August 2010 to April 2012 were included in CHD group, and healthy children receiving physical examination in this hospital during the same period as the control group. Twenty-four CHD cases and the same number of controls were selected to undergoTBX2 3′UTR DNA sequencing. According to our screening results, the identified variants were chosen for genotying by SNaPshot and association analysis in both groups. Then cell transfection and luciferase activity tests were conducted in functional analysis of the positive variant.ResultsA total of 768 cases were enrolled in CHD group, with mean age 6.1±4.8 years and 383 male subjects (49.9%). The control group included 660 subjects, with mean age 6.5±3.2 years and 354 male subjects (53.6%). ①Three known SNPs in 3′UTR were identified by DNA sequencing in our 24 CHDs and 24 controls: rs59382073, rs1058004 and rs729782. There was no novel variant. ②The initial association study in 288 cases and 288 controls indicated that genotypes of rs59382073 distributed significantly differently between groups (P=0.012), whereas no statistic disparity was observed for the rest two SNPs (P>0.05). Therefore, the two negative SNPs were not tested in the following subjects. ③Our all case-control analysis indicated thatTBX2 3′UTR rs59382073 variant was significantly associated with susceptibility of sporadic CHD. CT/TT genotype was significantly assocaited with higher risk of CHD (adjusted OR=2.13, 95%CI:1.51-2.99,P=1.44×10-5), and conotruncal defects (OR=2.75, 95%CI:1.57-4.81，P=3.99×10-4). And in stratified analysis, this association was further confirmed in tetralogy of Fallot (OR=3.18, 95%CI:1.53-6.61，P=1.90×10-3, compared with CC) and in ventricular septal defect(OR=1.70, 95%CI:1.17-2.46，P=5.14×10-3). ④Functional analysis of cells suggested that the luciferase activities of the T allele transfection were downregulated by 29.2% and 33.6% than the G allele in HEK 293T and H9C2 cells, respectively.ConclusionOverall, our data indicated thatTBX2 3′UTR rs59382073 polymorphism could significantly increase the susceptibility of sporadic CHD in Chinese Han population. The difference in luciferase activities between the two alleles demonstrates thatTBX2 3′UTR rs59382073 might be a functional polymorphism.

Congenital heart disease ;TBX2; Single nucleotide polymorphisms; 3′UTR

國家重大科學研究計劃(973計劃)：2013CB945401;國家自然科學基金：81170147,81300126

1 復旦大學附屬兒科醫(yī)院心血管中心 上海，201102; 2 濟南軍區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所 濟南,250022；3 復旦大學生命科學院 上海，200433

桂永浩，E-mail:yhgui@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.03.002

2015-03-03

2015-05-17)