厲曉杰 楊柳 劉建 羅卓荊

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是困擾絕經(jīng)后婦女健康的一大難題，據(jù)統(tǒng)計，發(fā)展中國家中有約 30% 的絕經(jīng)后婦女患有骨質(zhì)疏松[1-2]。高發(fā)病率、嚴(yán)重的并發(fā)癥以及為防治骨質(zhì)疏松而付出的沉重經(jīng)濟支出更加突出了骨質(zhì)疏松研究的緊迫性。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，活躍的骨吸收超過骨形成是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中骨量丟失的主要原因[3]。雌激素能抑制破骨細(xì)胞的分化并通過雌激素 α 受體促進成熟破骨細(xì)胞的凋亡[4]。因此，抑制因雌激素突然缺失而導(dǎo)致的破骨細(xì)胞活性過度增強成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的一種途徑。

Hedgehog 信號通路在骨組織中，能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和肥大，能促進間充質(zhì)干細(xì)胞 ( BMSC ) 向成骨方向分化[5-6]。在骨轉(zhuǎn)移瘤中，它促進破骨細(xì)胞的分化，從而促進骨吸收[7]。而在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中，Hedgehog 信號對破骨細(xì)胞的作用尚未研究清楚。

本研究采用體外模擬骨質(zhì)疏松情況，探究在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的條件下，Hedgehog 信號的改變情況及其對破骨細(xì)胞的作用。

材料與方法

一、主要試劑

RAW264.7 細(xì)胞購自 ATCC 公司；Murine M-CSF 購自 Peprotech 公司，以 50 ng / ml 濃度使用；RANKL 購自 California bioscience 公司，使用濃度為 100 ng / ml；Purmorphamine 購自 Merck Millipore公司，Vismdegib 購自 Selleck 公司，使用濃度均為1 μm；雌二醇購自 Sigma 公司，使用濃度為 10-8M；無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基購自 Gibico 公司；活性炭處理的胎牛血清 ( FBS ) 購自 Hyclone 公司；TRIzol 購自 Invitrogen 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Takara公司；SYBR green 染料購自 Takara 公司。

二、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立

6 只 8 周大小雌性 C57BL / 6J 小鼠，根據(jù)來源不同隨機數(shù)表法分成兩組：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型( OVX，Ovariotomized ) 組和假手術(shù)組，每組 3 只。OVX 組，切開背部皮膚，暴露并切除小鼠雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組，切開背部皮膚，暴露卵巢，切除附近脂肪組織[8]。切除卵巢后 8 周絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型建立完成，處死后取股骨，取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)。所有動物實驗操作均通過第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會通過 ( 20110405-5 )。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

小鼠股骨干來源的骨髓細(xì)胞添加于含 10% FBS和 50 ng / ml 的 M-CSF 的無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于含 5% CO2、37 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)后3 天，取貼壁細(xì)胞繼續(xù)用含有 10% FBS、50 ng / ml的 M-CSF 和 100 ng / ml 的 RANKL 的無酚紅 α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 天，獲得破骨細(xì)胞[9]。提取兩組細(xì)胞的總 RNA 并做實時定量 PCR 檢測 Hedgehog 信號通路活性標(biāo)志基因 Ptch1 和 Gli1 的表達(dá)水平 (表1)。

表1 實時定量 PCR 引物序列Fig.1 Real-time PCR primers sequence

RAW264.7 細(xì)胞以 1.5×104/ cm2密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板并隨機分為 6 組：雌激素組，給予雌二醇以 10-8M 濃度干預(yù)；雌激素＋激動劑組，給予10-8M 濃度雌二醇和 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號激動劑 Purmorphamine 進行干預(yù)；雌激素＋拮抗劑組，給予 10-8M 濃度雌二醇和 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預(yù)；對照組，不給予任何干預(yù)；激動劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號激動劑 Purmorphamine 進行干預(yù)；拮抗劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預(yù)。各組細(xì)胞用含有 100 ng / ml RANKL 的無酚紅α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 5 天，獲得破骨細(xì)胞，并進行 RNA 提取和定量 PCR[10]。

RAW264.7 細(xì)胞用含有 100 ng / ml RANKL 的無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 5 天，以進行 TRAP染色分析。隨機分為 3 組：雌激素組，給予雌二醇以 10-8M 濃度干預(yù)；拮抗劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預(yù)；對照組，不給予任何干預(yù)。

四、RNA 提取和定量 PCR

用 TRIzol 提取細(xì)胞總 RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為單鏈 cDNA。定量 PCR 采用SYBR Green 染料法以 SYBR Green 染料 12.5 μl、雙蒸水 9.5 μl、前后引物各 1 μl、cDNA 樣品 1 μl 配成反應(yīng)體系。利用 real time PCR 反應(yīng)儀 ( BIO-RAD 公司 ) 檢測各組樣品中各種基因表達(dá)量，并以 GAPDH基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)定量。

五、TRAP 染色

培養(yǎng)完成的細(xì)胞用 TRAP 試劑盒 ( Sigma ) 進行染色，固定細(xì)胞后，蒸餾水沖洗，加入 TRAP 染色液孵育 1 h，蒸餾水沖洗后用蘇木精復(fù)染，干燥后觀察。

六、F-actin 染色

細(xì)胞培養(yǎng)完成后棄培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗后加入 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞 10 min，PBS 沖洗，0.1%Triton X-100 PBS 溶液處理細(xì)胞 10 min，PBS 沖洗，加入鬼筆環(huán)肽 ( Cytoskeleton ) 工作液常溫孵育30 min，PBS 沖洗后加入 DAPI 常溫孵育 5 min，PBS沖洗后甘油封片。

表2 各組細(xì)胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達(dá) (±s)Fig.2 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

表2 各組細(xì)胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達(dá) (±s)Fig.2 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

基因 基因表達(dá)OVX 組 假手術(shù)組Ptch1 0.72400±0.04272 0.44196±0.06822 Gli1 0.66794±0.07331 0.45229±0.05750

表3 各組細(xì)胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達(dá) (±s)Fig.3 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

表3 各組細(xì)胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達(dá) (±s)Fig.3 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

基因表達(dá)雌激素組 對照組 雌激素 + 激動劑組 激動劑組 雌激素 + 拮抗劑組 拮抗劑組Ptch1 0.41317±0.02511 1.00000±0.11771 0.38557±0.06785 0.86403±0.05886 0.30162±0.02208 0.24563±0.02306 Gli1 0.54165±0.03931 0.74160±0.07632 1.00000±0.03138 1.45856±0.05911 0.26856±0.04111 0.32325±0.04611基因

七、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)值均采用表示，用 SPSS 16.0t檢驗進行兩兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、OVX 組和假手術(shù)組小鼠成熟破骨細(xì)胞中的Ptch1 和 Gli1 表達(dá)情況

OVX 組小鼠來源的破骨細(xì)胞 Ptch1 和 Gli1 基因表達(dá)水平均較假手術(shù)組小鼠來源的破骨細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 2，圖 1 )。說明在OVX 組中，Hedgehog 信號活性水平較高。

二、破骨細(xì)胞定量 PCR 結(jié)果定量 PCR

與對照組相比，雌激素刺激抑制了破骨細(xì)胞中Gli1 和 Ptch1 的表達(dá) (P＜0.05 )。與激動劑組相比，雌激素＋激動劑組中 Gli1 和 Ptch1 表達(dá)水平較低(P＜0.01 )。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素在破骨細(xì)胞中對Hedgehog 信號有抑制作用 ( 表 3，圖 2 )。

圖1 Ptch1 和 Gli1 在不同組細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of Ptch1 and Gli1 in different cell groups

圖2 Ptch1 和 Gli1 在不同組細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Ptch1 and Gli1 in different cell groups

三、TRAP 和 F-actin 染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)目

對照組破骨細(xì)胞數(shù)目較雌激素組多，而拮抗劑組破骨細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少，且恢復(fù)到雌激素存在情況下的正常生理數(shù)目。F-actin 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組中具有環(huán)狀細(xì)胞骨架的成熟破骨細(xì)胞的數(shù)目較雌激素組多，拮抗劑組中破骨細(xì)胞數(shù)目較對照組少。這說明，Hedgehog 信號抑制劑能將雌激素缺乏時過多的破骨細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)到雌激素存在時正常水平 (圖 3)。

討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松以其高發(fā)病率、嚴(yán)重并發(fā)癥和沉重的社會醫(yī)療費用負(fù)擔(dān)成為世界健康難題[11]。與其它類型的骨質(zhì)疏松不同的是，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。雌激素在骨中能維持成骨和破骨活動的平衡，絕經(jīng)后雌激素水平驟然下降，成骨與破骨平衡打破，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過度增強成為導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要因素。因此，破骨細(xì)胞成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要靶點。

Hedgehog 信號通路對于胚胎發(fā)育和多種組織代謝穩(wěn)態(tài)維持都有重要作用[12]。在骨骼系統(tǒng)中，它能促進間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，能調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和肥大，在骨轉(zhuǎn)移瘤的情況下，它還能促進破骨細(xì)胞的分化。本研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog 信號的標(biāo)志性基因 Ptch1 和 Gli1 在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松破骨細(xì)胞中表達(dá)水平升高。因此，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松破骨細(xì)胞中 Hedgehog 信號活性增強。為探究 Hedgehog信號增強是否與雌激素水平降低有關(guān)，筆者使用RAW264.7 細(xì)胞體外模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松條件，即人為去除或加入雌激素模擬絕經(jīng)后條件和正常條件。Purmorphamine 和 Vismdegib 分別是 Hedgehog 信號的激動劑和拮抗劑，作用與 Hedgehog 信號的 SMO受體，分別激動和抑制下游轉(zhuǎn)錄因子的活化。

本研究結(jié)果顯示，與雌激素存在時相比，去除雌激素時 Hedgehog 信號活性較高，而且雌激素能減弱 Hedgehog 激動劑對 Ptch1 和 Gli1 表達(dá)的促進作用，因此雌激素在破骨細(xì)胞中能抑制 Hedgehog信號。以上結(jié)果表明，破骨細(xì)胞中，雌激素對Hedgehog 信號有抑制作用。這可能是由于正常生理狀態(tài)下，雌激素維持在正常水平，而正常水平的雌激素對 Hedgehog 信號有一定的抑制作用，進而抑制了破骨細(xì)胞的分化成熟。絕經(jīng)后，雌激素水平驟然下降，雌激素對 Hedgehog 信號的抑制被解除，Hedgehog 活化，進而促進破骨細(xì)胞的形成，促進骨吸收，引起骨量下降。當(dāng)采用 Vismdegib 處理雌激素缺乏情況下的破骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，原過度激活的破骨細(xì)胞在 Vismdegib 的作用下被抑制，恢復(fù)到雌激素正常情況下的水平。

圖3 破骨細(xì)胞數(shù)目比較 a：不同組細(xì)胞 TRAP 染色結(jié)果；b：不同細(xì)胞 F-actin 染色Fig.3 Osteoclasts number in different groups a: TRAP staining; b: F-actin staining

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠破骨細(xì)胞中 Hedgehog 信號活性較高；破骨細(xì)胞中雌激素可抑制 Hedgehog 信號的活性，使破骨細(xì)胞活性恢復(fù)至正常情況，從而減少骨吸收，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中破骨細(xì)胞數(shù)目過多的狀況；同時，Hedgehog 信號通路抑制劑也具有相同的作用。因此，抑制 Hedgehog 信號通路可以作為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的新靶點。

[1] Reginster JY, Burlet N. Osteoporosis: a still increasing prevalence. Bone, 2006, 38(2 Suppl 1):S4-9.

[2] Sweet MG, Sweet JM, Jeremiah MP, et al. Diagnosis and treatment of osteoporosis. Am Fam Physician, 2009, 79(3):193-200.

[3] Rodan GA, Martin TJ. Therapeutic approaches to bone diseases. Science, 2000, 289(5484):1508-1514.

[4] Nakamura T, Imai Y, Matsumoto T, et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell, 2007, 130(5):811-823.

[5] Lanske B, Karaplis AC, Lee K, et al. PTH/PTHrP receptor in early development and Indian hedgehog-regulated bone growth.Science, 1996, 273(5275):663-666.

[6] Hojo H, Ohba S, Yano F, et al. Gli1 protein participates in Hedgehog-mediated specification of osteoblast lineage during endochondral ossification. J Biol Chem, 2012, 287(21):17860-17869.

[7] Das S, Samant RS, Shevde LA. Hedgehog signaling induced by breast cancer cells promotes osteoclastogenesis and osteolysis.J Biol Chem, 2011, 286(11):9612-9622.

[8] 宋佳峻. 糖皮質(zhì)激素與卵巢摘除后對大鼠骨量及骨代謝影響的對比研究. 中國骨與關(guān)節(jié)雜志, 2013, (2):84-89.

[9] Heller E, Hurchla MA, Xiang J, et al. Hedgehog signaling inhibition blocks growth of resistant tumors through effects on tumor microenvironment. Cancer Res, 2012, 72(4):897-907.

[10] Sun YL, Chen ZH, Chen XH, et al. Diamagnetic levitation promotes osteoclast differentiation from RAW264.7 cells. IEEE Trans Biomed Eng, 2014, 62(3)900-908.

[11] Hoerger TJ, Downs KE, Lakshmanan MC, et al. Healthcare use among U.S. women aged 45 and older: total costs and costs for selected postmenopausal health risks. J Womens Health Gend Based Med, 1999, 8(8):1077-1089.

[12] Briscoe J. Agonizing hedgehog. Nat Chem Biol, 2006, 2(1):10-11.