杜秀婷，羅　良，謝宛君，肖志勛，卓桂鋒，蘇　寧(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405)

慢性支氣管炎小鼠模型構(gòu)建方法的改良與評(píng)價(jià)*

杜秀婷，羅良，謝宛君，肖志勛，卓桂鋒，蘇寧△
(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405)

［摘要］目的:結(jié)合慢性支氣管炎的發(fā)病機(jī)制及致病因素，在以往單因素致病建模方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，探究一種較為準(zhǔn)確、可靠、符合慢性支氣管炎病理變化的模型。方法:慢支改良組(復(fù)合組)小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、14天分別經(jīng)氣管和經(jīng)鼻腔注入LPS，同時(shí)，于第2～30天(第14天除外)進(jìn)行被動(dòng)吸煙及SO2吸入; SO2組小鼠每天熏SO22 min;煙熏組小鼠每天吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，共約1 h;脂多糖組小鼠在造模第1天氣管注入LPS，第14天、30天進(jìn)行LPS滴鼻。各模型組均連續(xù)造模30 d。造模結(jié)束后通過對(duì)小鼠一般情況的觀察、肺泡灌洗液結(jié)果分析以及支氣管肺組織形態(tài)學(xué)觀察等評(píng)價(jià)改良后的慢支模型。結(jié)果:造模后各模型組小鼠出現(xiàn)鼻部潮濕，咳嗽，體毛干枯無光澤，拱背蜷縮，少動(dòng)，反應(yīng)較為遲鈍等癥狀，復(fù)合組的體質(zhì)量增長(zhǎng)最慢。從各組模型組病理切片可觀察到細(xì)支氣管壁周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腔內(nèi)炎性滲出明顯，氣道內(nèi)分泌物增多等病變;與煙熏組、二氧化硫組比較，慢支改良組肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)顯著增高(P＜0.01) ;慢支改良組與其它3組比較肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著升高(P＜0.01)，且煙熏組與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:煙熏、二氧化硫、LPS均可導(dǎo)致小鼠慢支疾病的發(fā)生，而從支氣管及肺組織病理學(xué)、肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)以及慢支的發(fā)病學(xué)等方面分析，復(fù)合因素造模更為符合慢支模型的構(gòu)建。

［關(guān)鍵詞］慢性支氣管炎;煙熏;二氧化硫;脂多糖

慢性支氣管炎(慢支)是由于感染、理化因素等長(zhǎng)期刺激而引起的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床上以咳嗽、咯痰或伴有喘息為主要癥狀［1］。慢支加速肺功能的下降，且病情日益惡化，降低了患者的生活質(zhì)量［2］。其經(jīng)常反復(fù)發(fā)作可并發(fā)慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病等疾病。目前對(duì)慢支的防治研究已受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。對(duì)于慢支的基礎(chǔ)研究，往往離不開慢支模型的成功復(fù)制。Kodavanti等［3］利用二氧化硫建立動(dòng)物氣道炎癥模型，Vlahos等［4］利用煙熏法建立小鼠肺部炎癥模型，近年來較為常用的是煙熏聯(lián)合脂多糖法。慢性支氣管炎由于病因復(fù)雜，臨床癥狀多樣，病程反復(fù)遷延，給動(dòng)物模型的合理模擬及觀測(cè)指標(biāo)的客觀、精確與量化帶來很大難度，研究進(jìn)展甚緩，多數(shù)研究仍停留于應(yīng)用傳統(tǒng)經(jīng)典方法，近年來雖有新的探索，但實(shí)用者甚少［5］。而到目前為止，國(guó)內(nèi)外仍未有一套標(biāo)準(zhǔn)化的慢支造模方式，各種造模方法良莠不齊，慢支模型的復(fù)制質(zhì)量仍是慢支基礎(chǔ)研究的一大障礙。為探究一種切實(shí)可行、復(fù)制成功率高的慢支模型建造方法，本實(shí)驗(yàn)通過總結(jié)近幾年來國(guó)內(nèi)外的慢支造模方式，結(jié)合慢性支氣管炎的發(fā)病機(jī)制及致病因素，在以往單因素致病建模方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，設(shè)計(jì)出脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)+煙熏-二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)吸入交替法建造慢性支氣管炎動(dòng)物模型。

材料和方法

1材料

1.1動(dòng)物健康4周齡昆明小鼠32只，雌雄不限，體質(zhì)量(20±4) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵) 2013-0020。

1.2煙熏材料芙蓉牌香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量13 mg)購(gòu)自湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。

1.3主要試劑與儀器Leica TP1020脫水機(jī)、Leica EG1600包埋機(jī)、Leica RM 2135輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica ST4040染色機(jī)、Olympus生物顯微鏡均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)西醫(yī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供;水合氯醛、靜脈導(dǎo)管針套管、LPS購(gòu)自Sigma;自制密閉煙熏箱;無水亞硫酸鈉、磷酸鹽緩沖液、甲醛溶液均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組健康4周齡昆明種小鼠32只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為復(fù)合組(脂多糖+煙熏-SO2吸入交替法)、SO2組(SO2吸入法)、煙熏組(煙熏法)、脂多糖組(脂多糖法)，每組8只。

2.2建造模型復(fù)合組小鼠:于實(shí)驗(yàn)第1天用5%劑量為0.1 mL/10 g的水合氯醛［6］麻醉后，仰臥、固定，剪開頸部皮膚，分離氣管，用微量進(jìn)樣器快速注入濃度為1 g/L的LPS 50 μg［7］，第14天按上述劑量麻醉后，用濃度為1 g/L的LPS滴鼻;同時(shí)，于第2～30天(第14天除外)在自制密閉煙熏箱(50 cm×50 cm×30 cm)內(nèi)交替進(jìn)行被動(dòng)吸煙及SO2吸入;吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，每天共約1 h; SO2吸入則取無水亞硫酸鈉0.4 g盛于小燒杯置于干燥瓶(7 L)中，加入30%硫酸0.4 mL反應(yīng)產(chǎn)生SO2氣體，將8只改良組小鼠分2次放入干燥瓶各熏2 min，每只小鼠每天熏1次。SO2組:取無水亞硫酸鈉0.4 g盛于小燒杯置于干燥瓶(7 L)中，加入30%硫酸0.4 mL反應(yīng)產(chǎn)生SO2氣體，將SO2組小鼠(8只)分2次放入干燥瓶中各熏2 min，每天1次，連續(xù)30 d。煙熏組小鼠置于自制密閉煙熏箱(50 cm×40 cm×30 cm)內(nèi)交替進(jìn)行被動(dòng)吸煙;吸煙4支/次，直至1包煙燃燒完畢，共約1 h，造模30 d。脂多糖組小鼠(8 只)在第1天用5%劑量為0.1 mL/10g的水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)，剪開頸部皮膚，分離氣管，用微量進(jìn)樣器快速注入濃度為1 g/L 的LPS 50 μg;第14天、30天按上述劑量麻醉后，用濃度為1 g/L的LPS滴鼻，共造模30 d。

2.3一般情況的觀察觀測(cè)小鼠的活動(dòng)度、對(duì)外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛光澤、飲食、飲水、死亡情況。造模前、造模1月后，取標(biāo)本前稱重，觀察體重的變化。慢支模型組小鼠有明顯的咳嗽、鼻部潮濕，食少，體毛干枯無光澤，拱背蜷睡，少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，食少，體重下降等表現(xiàn)［8］。

2.4支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)分析用5%劑量為0.1 mL/10 g的水合氯醛麻醉小鼠，氣管前方切開皮膚，鈍性分離暴露氣管，使用磷酸鹽緩沖液1.5 mL行支氣管肺泡灌洗(分3次，每次0.5 mL)，回收肺泡灌洗液共約1 mL，4℃離心10 min，1 500 r/min，回收上清液－20℃保存，用1 mL含有1% BSA的PBS重懸細(xì)胞沉淀，取10 μL重懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.5支氣管肺組織形態(tài)學(xué)觀察取左肺于10%的甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明標(biāo)本，浸蠟、包埋、切片、HE染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

2.6炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)取每個(gè)樣本切片置于400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)抽取5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件手動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件行單因素方差(one-way ANOVA)分析，2組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1.The mice were induced by different methods for modeling of chronic bronchitis.A: in the smoking process (smoking group)，the mice were restless and tachypneic in the first half hour; B: in the smoking process (smoking group)，the mice were slow down in response in the other half hour; C: in the SO2group，the mice had experienced symptoms including wet nose，cough，moist hair，dysphoria，dyspnea，etc; D: after intratracheal instillation of LPS (LPS group)，the mice were under anaesthetic.圖1小鼠受不同方法誘導(dǎo)建立慢性支氣管炎病理模型的大體表現(xiàn)

結(jié)果

1小鼠慢支模型的一般狀況觀察

造模前，小鼠活動(dòng)度正常，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，飲食、飲水均正常，體重為20～25 g。造模過程中，煙熏組小鼠在煙熏過程的前半小時(shí)躁動(dòng)不安，跳動(dòng)，呼吸急促;后半小時(shí)全身濕潤(rùn)，鼻部潮濕，呼吸急促，少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍。二氧化硫組小鼠躁動(dòng)，攀爬，呼吸急促困難，口張開，皮毛濕潤(rùn)。LPS組小鼠第1次氣管內(nèi)注入LPS，其后2次均滴鼻注入LPS，麻醉過程中活動(dòng)度減少，逐漸昏迷，滴鼻后全部蘇醒。復(fù)合組上述表現(xiàn)較為明顯，外形較顯出消瘦。造模后各模型組小鼠出現(xiàn)鼻部潮濕，咳嗽，體毛干枯無光澤，拱背蜷縮，少動(dòng)，反應(yīng)較為遲鈍等癥狀，見圖1。

2支氣管肺組織形態(tài)學(xué)觀察

各組小鼠肺組織均有不同程度的滲出、水腫、出血，支氣管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)有少量分泌物和炎癥細(xì)胞，肺泡間隔增寬，內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，部分肺泡壁變薄、斷裂，肺泡過度擴(kuò)大融合，肺泡數(shù)減少，呈肺氣腫病變，部分肺泡腔內(nèi)可見滲出物、紅細(xì)胞。其中煙熏組細(xì)支氣管管腔內(nèi)分泌物增多，肺泡形態(tài)破壞情況較輕;二氧化硫組肺泡形態(tài)破壞較為嚴(yán)重，大量肺泡壁變薄、斷裂，融合成肺大泡，正常肺泡數(shù)明顯減少;脂多糖組黏膜上皮損傷較嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞;復(fù)合組氣管周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、管腔內(nèi)滲出物增多，見圖2。

3支氣管肺泡灌洗液分析結(jié)果

由不同造模方式建造的4組慢支模型的小鼠均出現(xiàn)不同程度的慢支病變。小鼠造模后進(jìn)行肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)，各組結(jié)果如表1所示。與煙熏組比較，其它3組肺泡灌洗液的白細(xì)胞總數(shù)增高，差異顯著(P＜0.05) ;與二氧化硫組比較，LPS組和復(fù)合組肺泡灌洗液的白細(xì)胞總數(shù)增高(P＜0.05) ;與LPS組比較，復(fù)合組肺泡灌洗液的白細(xì)胞總數(shù)增高，但差異不顯著。說明不同的單因素刺激對(duì)小鼠慢支的形成存在一定的差異，而復(fù)合因素造模后使肺泡灌洗液的白細(xì)胞總數(shù)增高最為明顯。

4病理切片炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

運(yùn)用4種不同造模方式造模后，與煙熏組比較，其它3組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞數(shù)均有增高，其中LPS組與復(fù)合組具有顯著差異(P＜0.05) ;與二氧化硫組比較，復(fù)合組肺組織炎癥細(xì)胞數(shù)增高(P＜0.01) ;與LPS組比較，復(fù)合組肺組織炎癥細(xì)胞數(shù)增高，具有顯著差異(P＜0.01)。說明不同造模方式可促進(jìn)小鼠支氣管、肺泡、肺泡間隔、血管等肺部結(jié)構(gòu)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中復(fù)合因素刺激作用更為明顯，見表1。

討論

吸煙所致煙霧對(duì)呼吸道的長(zhǎng)期刺激是慢性支氣管炎最重要的病因。紙煙所含的焦油和菸堿可增加副交感神經(jīng)興奮性，使支氣管收縮痙攣，增加氣道阻力;同時(shí)，支氣管黏膜腺體增生與肥大，杯狀細(xì)胞增生與鱗狀上皮細(xì)胞化生，黏膜分泌增多與積聚，上皮細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)受抑制;黏膜充血、水腫，肺泡吞噬細(xì)胞功能降低，使氣道凈化能力減弱，均易引起感染。吸煙時(shí)間愈長(zhǎng)，煙量愈大，患病率也愈高。吸煙者的患病率比不吸煙者高約2～8倍。戒煙后可緩解病情，使癥狀減輕或消失。煙熏法可成功復(fù)制慢性支氣管炎動(dòng)物模型。吸入刺激性氣體SO2，復(fù)制慢性支氣管炎，能可靠地引起慢性支氣管炎病理變化和氣流阻塞。脂多糖是革蘭陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)，也是重要的致炎因子，可直接引起氣道上皮損傷，導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞激活和細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)氣道炎癥［9］。大鼠氣管內(nèi)滴注脂多糖1 mg/kg可復(fù)制急性肺損傷模型，出現(xiàn)富含蛋白、纖維蛋白的肺泡分泌液和彌漫性嗜中性細(xì)胞肺泡炎。大鼠氣管內(nèi)滴注胰彈性蛋白酶和人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶引起可逆性支氣管上皮黏液細(xì)胞化生［10］。因此，根據(jù)慢支的病因病機(jī)和病理變化，慢支模型常來源于肺炎克雷伯桿菌和肺炎鏈球菌、脂多糖、香煙煙霧、刺激氣體等致病因素。

Figure 2.The biopsy of the lung tissues in the mice with different chronic bronchitis modeling methods (HE staining).圖2不同方法誘導(dǎo)慢性支氣管炎小鼠模型的支氣管肺組織形態(tài)學(xué)觀察

表1　不同造模方法對(duì)小鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞和肺組織炎癥細(xì)胞的影響Table 1.The effects of 4 modeling methods on the leukocyte count in BALF and inflammatory cells number in the lung tissue of the mice (Mean±SD.n=8)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)痰多、黏稠主要從氣道黏液高分泌的角度研究。慢支、COPD的發(fā)生發(fā)展過程中，由于感染、變應(yīng)原、刺激性氣體和煙霧等有害因素的作用，使炎性細(xì)胞和氣道黏膜、黏膜下細(xì)胞受損而釋放多種炎性介質(zhì)，刺激氣道上皮杯狀細(xì)胞增生、化生及黏膜下腺體增生肥大，導(dǎo)致氣道分泌亢進(jìn)，表現(xiàn)為黏液的量和黏稠度明顯增高［11］。氣道炎癥是慢支病理機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12］。煙草中含有多種有害成分如焦油、尼古丁、一氧化碳和各種粉塵顆粒［13］。長(zhǎng)期吸煙可引發(fā)慢性支氣管炎、肺氣腫及慢性阻塞性肺疾病等肺損害［14-15］。因此，吸煙是慢支形成的一個(gè)重要的致病因素;脂多糖存在于革蘭陰性菌的細(xì)胞外壁，主要由類脂質(zhì)和多糖構(gòu)成，在環(huán)境中普遍存在。研究表明，慢支并非全部由吸煙引起的，其它一些環(huán)境暴露或職業(yè)性暴露也是慢支的重要致病因素，而這些環(huán)境或職業(yè)性暴露如有機(jī)粉塵等的微生物成分就含內(nèi)毒素。另外，刺激性煙霧、有害氣體如SO2，對(duì)支氣管黏膜造成損傷，造成支氣管杯狀細(xì)胞增生，黏膜分泌增加，為細(xì)菌侵入創(chuàng)造條件。

慢性支氣管炎可能是多種因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。根據(jù)導(dǎo)致慢支發(fā)生的感染、刺激性氣體、吸煙等致病因素，本實(shí)驗(yàn)通過煙熏、二氧化硫、LPS以及復(fù)合法建造4組慢支模型，從小鼠的臨床癥狀，體征以及病理分析、肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)增加、肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)量增高等說明成功建立小鼠慢性支氣管炎模型，其中復(fù)合組的體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度較小，肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)幅度較大，以及結(jié)合慢支致病因素的多元化表明復(fù)合因素刺激更為符合慢支模型的構(gòu)建。

復(fù)合致病因素改良法和以往的吸煙與脂多糖聯(lián)合法相比，其特點(diǎn)是增加了以二氧化硫?yàn)榇淼目諝馕廴局虏∫蛩?，體現(xiàn)了在慢支發(fā)生過程中，空氣中的刺激性煙霧和有害氣體如二氧化硫的危害性，更有力地說明慢支是由多種因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果，提示在臨床上避免吸煙、空氣污染、感染等慢支主要致病因素的侵襲將有利于降低慢性支氣管炎的發(fā)病率，進(jìn)一步揭示了人類日常生活中多因素致病的現(xiàn)實(shí)情況。

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(責(zé)任編輯:林白霜，余小慧)

Improvement and evaluation of chronic bronchitis modeling methods in mice

DU Xiu-ting，LUO Liang，XIE Wan-jun，XIAO Zhi-xun，ZHUO Gui-feng，SU Ning
(Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China.E-mail: d1121352956@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore a more accurate and reliable pathological model of the chronic bronchitis，which has improved from the former single-factor modeling method of the disease.METHODS: The mice in complex group were treated with lipopolysaccharide (LPS) by tracheal injection on the 1st day and nasal drops on the 14th day，and from the 2nd day to 30th day，the animals were given passive smoking and sulfur dioxide (SO2) inhalation (except on the 14th day).The mice in SO2group were exposed to SO22 min per day，while in smoking group，the mice were exposed to smoke for about 1 h per day (4 cigarettes each time until one pack of cigarettes were burning up).In LPS group，the mice had tracheal injection of LPS on the 1st day and nasal drops of LPS on the 14th day and 30th day.Every modeling process lasted for 30 days.After modeling，the improvement of chronic bronchitis model was evaluated by testing the general conditions of the mice，analyzing leukocyte count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)，and observing the morphological changes of the bronchial and lung tissues.RESULTS: After modeling，the mice in every model group experienced symptoms including wet nose，cough，dry and lusterless hair，arched back and curled-up body，showing inactive，and slow down in response.The mice in complex group gained the lowest weight compared to other groups.From each model group，the inflammatory cells infiltrated evidently around the bronchial walls，especially in the bronchial cavity，and the mucilage secretion in the airway increased.The total number of leukocytes in BALF increased significantly in complex group.The inflammatory cell count in the lung tissue indicated that the mice in complex group had significantly higher levels of inflammatory cell infiltration.Besides，the comparison between smoke group and LPS group was statistically significant.CONCLUSION: Smoking，SO2inhalation and LPS injection induce bronchial lung disease in mice，and the complex chronic bronchitis mouse model is a better model with the pathological changes of bronchus，lung tissue and BALF，and pathogenesis of chronic bronchitis.

［KEY WORDS］Chronic bronchitis; Smoking; Sulfur dioxide; Lipopolysaccharide

通訊作者△Tel: 020-39358038; E-mail: d1121352956@163.com

*［基金項(xiàng)目］廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(No.1057213013)

［收稿日期］2015-04-20［修回日期］2015-05-29

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1724-05

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.035