丁西朋 羅小燕 賈慶麟 白昌軍

摘 ?要 ?柱花草（Stylosanthes spp.）是我國(guó)南方熱帶地區(qū)優(yōu)良豆科牧草。為獲得高效的柱花草分子標(biāo)記，本課題組利用熱研5號(hào)圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)了2008個(gè)EST-SSR標(biāo)記。為驗(yàn)證新EST-SSR標(biāo)記的有效性及在柱花草屬中的通用性，本研究從中隨機(jī)挑選117個(gè)EST-SSR標(biāo)記并分析了其在圭亞那柱花草中的有效性及其在其他8種柱花草中的可轉(zhuǎn)移性。結(jié)果表明，有98個(gè)EST-SSR標(biāo)記可獲得有效擴(kuò)增，其中96個(gè)在不同柱花草種質(zhì)間有多態(tài)性，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)出的等位基因2～11個(gè)，共檢測(cè)到等位基因456個(gè)。98個(gè)EST-SSR標(biāo)記在其他8種柱花草間的可轉(zhuǎn)移率為82.2%～100%，其中69個(gè)標(biāo)記在8種柱花草間都能有效擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞 ?柱花草;EST-SSR;標(biāo)記開發(fā);遺傳多樣性分析

中圖分類號(hào) ?S541 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Transferability of Novel EST-SSR Markers in Stylosanthes

guianensis Across the Species of Stylosanthes

DING Xipeng， LUO Xiaoyan， JIA Qinglin， BAI Changjun*

Institute of Tropical Crops Genetic Resources， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ?To obtain effective molecular markers for Stylosanthes which is one of the most excellent legume forages， 2008 EST-SSR markers were developed using the transcriptomic sequences from S. guianensis cv. Reyan No.5. To assess the usefulness and universality of these novel EST-SSR markers within Stylosanthes genus， 117 EST-SSR markers were selected to determine the usefulness in S. guianensis and the transferability among other close eight species. The results showed that 98 of 117 EST-SSR markers were able to produce reliable bands with expected sizes and 96 markers were polymorphic， with 2～11 alleles among different Stylosanthes accessions. The transferability of 98 validated EST-SSR markers across other close eight species was very high， ranging from 82.2% to 100%， and 69 markers of them were common in all eight species of Stylosanthes. The results would provide a basis for the application of EST-SSR in genetic diversity， construction of genetic maps， and molecular marker-assisted selection breeding in stylo species.

Key words ?Stylosanthes spp.; EST-SSR; Marker-development; Genetic diversity

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.006

分子標(biāo)記是作物遺傳學(xué)研究和分子標(biāo)記輔助育種的重要工具，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡(jiǎn)單等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，在水稻、擬南芥、玉米等多種植物中被開發(fā)并應(yīng)用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等方面[1-2]。根據(jù)來源不同，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR（genomic-SSR）和 EST-SSR兩種[3]。EST-SSR標(biāo)記是基于EST 序列開發(fā)的SSR標(biāo)記，與傳統(tǒng)的genomic-SSR標(biāo)記開發(fā)相比較，不僅開發(fā)速度快，且成本低。由于EST-SSR來源于表達(dá)的基因組區(qū)域，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)，從而強(qiáng)化了EST-SSR標(biāo)記在遺傳學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用[4]。此外，由于EST序列比基因組DNA序列相對(duì)保守，所以EST-SSR標(biāo)記相對(duì)于genomic-SSR標(biāo)記在不同種間的通用性更高，但多態(tài)性較低[5]。近年來，隨著EST序列的迅速發(fā)展，基于EST的SSR標(biāo)記開發(fā)也在日趨增加。目前，EST-SSR標(biāo)記已在苜蓿[6-7]、羊草[8]、木豆[9]、黑麥草[10]等牧草中得到開發(fā)和應(yīng)用。

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆，為多年生豆科植物，原產(chǎn)于拉丁美洲。因其適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、抗旱、飼草產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，兼具改良土壤、水土保持的功效，是全球熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)良豆科牧草之一[11]。柱花草屬包含約50個(gè)種，常用的栽培品種主要來自圭亞那柱花草（Styosanthes guianensis）、有鉤柱花草（S. hamata）、糙柱花草（S. scabra）和頭狀柱花草（S. macrocephala）等。1957年，我國(guó)開始柱花草的引種選育與栽培研究，先后選育出維拉諾有鉤柱花草（S. hamata ‘Verano）、熱研5號(hào)圭亞那柱花草（S. guianensis ‘Reyan No. 5）、西卡糙柱花草（S. scabra‘Seca）等12個(gè)柱花草優(yōu)良品種[12]。目前，國(guó)內(nèi)外柱花草遺傳學(xué)研究的報(bào)道以RAPD、AFLP和ISSR等分子標(biāo)記為主，柱花草SSR標(biāo)記開發(fā)及驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道非常有限，極大地限制了該標(biāo)記在柱花草遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[13]。本課題組已利用熱研5號(hào)圭亞那柱花草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)了EST-SSR標(biāo)記2008個(gè)，本研究從中隨機(jī)挑選117個(gè)EST-SSR標(biāo)記，驗(yàn)證了新開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記的有效性和實(shí)用性，并分析了其在不同柱花草種間的可轉(zhuǎn)移性，為利用EST-SSR 標(biāo)記開展柱花草遺傳學(xué)研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ? 來自9個(gè)不同柱花草種的12份柱花草種質(zhì)（表1），包括4份圭亞那柱花草種質(zhì)和8份其他不同種的柱花草種質(zhì)，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心收集。

1.1.2 ?試劑 ? 挑選的117對(duì)EST-SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表2），試驗(yàn)中Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer（含Mg2+）及DL 2 000均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料種植及取樣 ? 將去皮的柱花草種子置于80 ℃水中浸泡5 min，然后在25 ℃恒溫條件下的人工智能氣候箱中進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽后移植至14 L塑料盆中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)1個(gè)月后，每份種質(zhì)隨機(jī)挑選5株，對(duì)葉片進(jìn)行混合取樣，置于液氮保存，用于DNA抽提。

1.2.2 ?基因組總DNA抽提 ? 利用改良的CTAB法從柱花草葉片中提取基因組總DNA[14]，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，然后用NanoVue超微量分光光度計(jì)（GE Healthcare）測(cè)定其濃度，將DNA濃度稀釋至100 ng/μL后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 ?PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) ? PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括2.0 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），1.0 μL模板DNA（100 ng/μL），0.4 μL正向引物 （10 μmol/L），0.4 μL反向引物（10 μmol/L），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.3 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），剩余體積用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8% PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）電泳后，采用硝酸銀法染色，最后照相記錄[14]。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小以DL 2 000 DNA marker作為分子量參考來讀取，對(duì)大小合適、清晰且易于辨認(rèn)的譜帶采用“0，1”系統(tǒng)記錄其位置，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”。所記錄的原始數(shù)據(jù)匯總到Excel表格中并形成數(shù)據(jù)矩陣，用于擴(kuò)增條帶的多態(tài)性比較和聚類分析。利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析柱花草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（Genetic Similarity， GS），然后利用GS值采用非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means， UPGMA）對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析[15]。利用POPGENE 1.32軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Shannon指數(shù)[16]。每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（Polymorphic Information Content， PIC）按公式PIC=1-∑k Pi2進(jìn)行計(jì)算，k表示每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)目，Pi表示第i個(gè)等位基因在供試材料中出現(xiàn)的頻率[17]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?柱花草新EST-SSR標(biāo)記的有效性

在轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)拼接過程中存在的誤差、EST對(duì)應(yīng)DNA 序列存在的內(nèi)含子或引物存在的非特異性結(jié)合位點(diǎn)等原因，都會(huì)引起其對(duì)應(yīng)EST-SSR標(biāo)記無效。本研究結(jié)果表明：在117對(duì)EST-SSR引物中，98對(duì)在4份圭亞那柱花草種質(zhì)中均可獲得大小合適、條帶清晰的譜帶，確定為有效引物，占總引物的83.76%。剩下的19對(duì)中有9對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物偏大、5對(duì)（RM15、RM44、RM66、RM164和RM170）沒有產(chǎn)物、5對(duì)（RM13、RM20、RM72、RM124和RM148）有多條帶（表2）。

2.2 ?圭亞那柱花草新EST-SSR標(biāo)記在8種柱花草間的可轉(zhuǎn)移性

不同的EST-SSR標(biāo)記在柱花草種間的轉(zhuǎn)移率不同。在98個(gè)有效引物檢測(cè)到的101個(gè)SSR位點(diǎn)中，有31個(gè)位點(diǎn)至少在1個(gè)柱花草種中無擴(kuò)增產(chǎn)物（表3），其中有10個(gè)SSR位點(diǎn)只在1種柱花草中檢測(cè)不到，可轉(zhuǎn)移率為87.5%;有10個(gè)SSR位點(diǎn)在2種柱花草中不能被檢測(cè)到，可轉(zhuǎn)移率為75.0%;有4個(gè)SSR位點(diǎn)在3種柱花草中檢測(cè)不到，可轉(zhuǎn)移率為62.5%;有2個(gè)SSR位點(diǎn)（RM132和RM153）在4種柱花草中檢測(cè)不到，可轉(zhuǎn)移率為50.0%;有4個(gè)SSR位點(diǎn)在6種柱花草中不能被檢測(cè)到，可轉(zhuǎn)移率為25.0%;只有1個(gè)SSR點(diǎn)（RM74-1）在7種柱花草中不能被檢測(cè)到，可轉(zhuǎn)移率為12.5%。剩下的70個(gè)位點(diǎn)（占總位點(diǎn)數(shù)的69.31%）在供試的其他8個(gè)柱花草種中都可以檢測(cè)到（表3），說明大部分新EST-SSR標(biāo)記在不同柱花草種中具有較高的通用性。

98個(gè)有效EST-SSR引物在8種不同柱花草種間的可轉(zhuǎn)移性存在較大的差異，可轉(zhuǎn)移率為82.2%～100%（表3）。其中，在大頭柱花草（S. macrocephala）中可檢測(cè)到有效位點(diǎn)83個(gè)，可轉(zhuǎn)移率為82.2%，在粘質(zhì)柱花草（S. viscosa）和狹葉柱花草（S. angustifolia）中均可檢測(cè)到有效位點(diǎn)84個(gè)，可轉(zhuǎn)移率為83.2%。相比而言，在有鉤柱花草（S. hamata）和糙柱花草（S. scabra）中有92個(gè)有效位點(diǎn)可被檢測(cè)到，可轉(zhuǎn)移率達(dá)到91.1%，在矮柱花草（S. humilis）和細(xì)莖柱花草（S. gracilis）中有94個(gè)有效位點(diǎn)可被檢測(cè)到，可轉(zhuǎn)移率達(dá)到93.1%，而在馬弓形柱花草（S. hippocampoides）有效引物的可轉(zhuǎn)移率達(dá)到了100%。由此可見，不同柱花草種的遺傳背景存在明顯差異，因而檢測(cè)得到EST-SSR位點(diǎn)的數(shù)量和位置也表現(xiàn)出差別，說明篩選獲得的可轉(zhuǎn)移性EST-SSR引物可以對(duì)不同柱花草種進(jìn)行有效區(qū)分。

2.3 ?EST-SSR標(biāo)記特征分析

在98對(duì)有效引物中共檢測(cè)到SSR位點(diǎn)101個(gè)，其中RM74、RM76和RM138均擴(kuò)增出2個(gè)SSR位點(diǎn)（表2）。在101個(gè)檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)中，只有2個(gè)位點(diǎn)（RM106和RM120）在12份柱花草種質(zhì)中沒有多態(tài)性，其他99個(gè)位點(diǎn)均有多態(tài)性，共檢測(cè)到456個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)4.61個(gè)等位基因（表2）。其中6個(gè)位點(diǎn)有2個(gè)等位基因，21個(gè)位點(diǎn)有3個(gè)等位基因，20個(gè)位點(diǎn)有4個(gè)等位基因，29個(gè)位點(diǎn)有5個(gè)等位基因，13個(gè)位點(diǎn)有6個(gè)等位基因，7個(gè)位點(diǎn)有7個(gè)等位基因，RM75、RM146和RM163分別有8、10和11個(gè)等位基因（圖1）。

利用POPGENE 1.32軟件分析每個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果顯示，99個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的觀察雜合度（Ho）的變化范圍為0.000～0.400，平均值為0.083，而期望雜合度（He）的變化范圍為0.159～0.928，平均值為0.658（表4）。各多態(tài)性位點(diǎn)的PIC值變化范圍為0.153～0.889，平均為0.629，其中PIC<0.25的只有2個(gè)分子標(biāo)記（RM74-2和RM172），而PIC>0.5的有78個(gè)位點(diǎn)，占總多態(tài)性位點(diǎn)的78.79%。位點(diǎn)RM74-2的PIC值最低為0.153，RM146的PIC值最高為0.889（表4）。各多態(tài)性位點(diǎn)的Shannon指數(shù)變異范圍為0.287～2.268，其平均值為1.228，同樣表明了新開發(fā)EST-SSR標(biāo)記較好的多態(tài)性。

2.4 ?遺傳多樣性分析

利用NTSYS-pc 2.10e分析軟件，根據(jù)98個(gè)有效引物的數(shù)據(jù)分析12份柱花草種質(zhì)的遺傳多樣性，結(jié)果表明，所有供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS變化范圍為0.57～0.87，平均為0.69，說明這12份柱花草種質(zhì)間的遺傳多樣性比較豐富。其中，圭亞那柱花草熱研5號(hào)與圭亞那柱花草GC1581的遺傳相似性最大，GS值為0.87，這可能是因?yàn)樗鼈儊碜怨鐏喣侵ú莘N中相同的亞種（圭亞那亞種）;其次，糙柱花草CIAT66和粘質(zhì)柱花草CIAT1011的遺傳相似性也較大，GS值為0.80，可能是由于粘質(zhì)柱花草是糙柱花草祖先之一的原因[18];而圭亞那柱花草GC1581和糙柱花草CIAT66的遺傳相似性最小，GS值為0.57。

基于多態(tài)性SSR引物的UPGMA聚類分析結(jié)果表明，12份來自不同種的柱花草種質(zhì)可以明顯地被分為2大類（圖2）。熱研5號(hào)柱花草、GC1581柱花草、CIAT1283柱花草、CIAT10121柱花草、Fine stem柱花草和CIAT1361柱花草被歸為一類，其中前4份種質(zhì)都屬于圭亞那柱花草，F(xiàn)ine stem柱花草屬于馬弓形柱花草，CIAT1361柱花草屬于細(xì)莖柱花草，雖然它們屬于不同的種，但是它們具有相同類型的基因組（G類）[17]。剩下的矮柱花草CIAT58、狹葉柱花草CIAT1291、有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66、粘質(zhì)柱花草CIAT1011和大頭柱花草CIAT1643被歸為一類。其中有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66和粘質(zhì)柱花草CIAT1011雖然屬于不同的種，倍性也不相同，但擁有相同類型的基因組（有鉤柱花草A類，糙柱花草AB類，粘質(zhì)柱花草A類）[18]，所以它們的親緣關(guān)系比較近。

3 ?討論與結(jié)論

本研究檢測(cè)的117對(duì)EST-SSR引物中，98對(duì)可獲得大小合適、條帶清晰的譜帶，有效引物比例（83.76%）和甘薯中EST-SSR引物的有效引物比例（84.6%）相近[19]，高于木豆（71.24%）[9]、苜蓿（62.96%）[7]和茶葉（59.9%）[20]，但低于苧麻（98.0%）[21]。引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物可能是因?yàn)镋ST-SSR位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DNA序列中存在較大內(nèi)含子或不同剪切方式造成的，擴(kuò)增產(chǎn)物偏大可能是由于EST-SSR位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DNA序列中存在內(nèi)含子造成的，而擴(kuò)增條帶偏多可能是因?yàn)橐锓翘禺愋越Y(jié)合引起的。

不同SSR引物對(duì)應(yīng)序列的保守性不一樣，所以不同SSR引物在柱花草種間的可轉(zhuǎn)移性不同。本研究98對(duì)有效引物共檢測(cè)到101個(gè)SSR位點(diǎn)，在8種柱花草間的可轉(zhuǎn)移率為12.5%～100%，平均可轉(zhuǎn)移率為89.36%。Chandra等[12]開發(fā)的21個(gè)genomic-SSR標(biāo)記在柱花草種間的可轉(zhuǎn)移率為0～100%，平均僅為45.24%，而20個(gè)EST-SSR標(biāo)記在柱花草種間的可轉(zhuǎn)移率為40%～100%，平均為82.0%。由于不同柱花草種遺傳背景的差異，SSR引物在不同柱花草種間的可轉(zhuǎn)移性存在較大差異。本研究有效EST-SSR標(biāo)記在8種不同柱花草中的可轉(zhuǎn)移率為82.2%～100%，平均為89.63%。Santos等[22]開發(fā)的genomic-SSR標(biāo)記在3種柱花草間的可轉(zhuǎn)移率為35%～50%，平均為40.0%。Chandra等[12]開發(fā)的genomic-SSR標(biāo)記在4種柱花草間的可轉(zhuǎn)移率為38.1%～61.9%，平均為45.25%，而EST-SSR標(biāo)記在5種柱花草間的可轉(zhuǎn)移率為78.9%～94.7%，平均為85.72%。無論是單個(gè)標(biāo)記還是在不同種間，EST-SSR標(biāo)記的可轉(zhuǎn)移率都明顯大于genomic-SSR。

據(jù)Bostein等[23]提出的衡量分子標(biāo)記多態(tài)性標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該分子標(biāo)記為高多態(tài)性標(biāo)記，當(dāng)0.5>PIC>0.25時(shí)，該分子標(biāo)記為中多態(tài)性標(biāo)記，當(dāng)PIC<0.25時(shí)，該分子標(biāo)記為低多態(tài)性標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示99個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，PIC>0.5的有78個(gè)位點(diǎn)，占總多態(tài)性位點(diǎn)的78.79%，表明新開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有很好的多態(tài)性和應(yīng)用價(jià)值。

聚類分析可將12份柱花草種質(zhì)分為2大類（圖2），這與利用STS標(biāo)記[24-25]，RFLP標(biāo)記[25-26]和ITS標(biāo)記[27]對(duì)柱花草種間親緣關(guān)系的研究結(jié)果相一致。在Ⅰ類中，3種柱花草的基因組都屬于G類。馬弓形柱花草和細(xì)莖柱花草原本都被視為圭亞那柱花草的一個(gè)亞種[18]，Calles和Schultze-Kraft[28]將細(xì)莖柱花草重新定義為一個(gè)種，而馬弓形柱花草至今無定論。在Ⅱ類中，雖然有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66和粘質(zhì)柱花草CIAT1011屬于不同的種，但它們擁有相同類型的基因組（A類），所以親緣關(guān)系比較近[18]。

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