魯琰 鄒瀟瀟 黃惠琴 劉敏 鮑時(shí)翔

摘 ?要 ?為了探討南方根結(jié)線蟲在植物體外被穿刺巴斯德芽菌感染后存活率的變化及感染初期線蟲壽命和生殖相關(guān)基因的表達(dá)情況。首先利用單卵塊孵化法對(duì)從野外采集的根結(jié)線蟲進(jìn)行純化和分子鑒定。以穿刺巴斯德芽菌孢子體外吸附的南方根結(jié)線蟲為材料，在顯微鏡下觀察供試線蟲的存活情況，每24 h計(jì)數(shù)一次死亡線蟲的條數(shù)，總共觀察12 d。在被穿刺巴斯德芽菌吸附的第3天收集根結(jié)線蟲，提取線蟲總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)線蟲壽命相關(guān)基因cyp-33和生殖相關(guān)基因lin-45/mek-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明：通過(guò)分子鑒定確認(rèn)純化的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲;感染了穿刺巴斯德芽菌的南方根結(jié)線蟲死亡率顯著升高;同時(shí)在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲的初期，線蟲壽命相關(guān)基因cyp-33和生殖相關(guān)基因lin-45/mek-2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均下調(diào)（p<0.05）。這說(shuō)明穿刺巴斯德芽菌在吸附南方根結(jié)線蟲的初期能夠促使線蟲的存活率降低，并抑制其生殖能力，這可能與基因cyp-33、lin-45和mek-2的調(diào)控有關(guān)。

關(guān)鍵詞 ?南方根結(jié)線蟲;穿刺巴斯德芽菌;熒光定量PCR;存活率

中圖分類號(hào) ?R383.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Expression Changes of Life-related and Reproduction-related

Genes of Meloidogyne Incognita Infected by Pasteuria Penetrans

LU Yan1，2，3， ZOU Xiaoxiao2， HUANG Huiqin2， LIU Min2， BAO Shixiang2*

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

3 Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571199， China

Abstract In order to investigate the influence of Pasteuria penetrans on the survival rate of Meloidogyne incognita and the expression of life-related gene and reproduction-related gene at the beginning of adsorption，the authors purified M. incognita collected from wild and identified it with molecular biology methods firstly. Then M. incognita was adsorpted by P penetrans in vitro. Within twelve days the researchers observed M. incognita with microscope and counted the number of dead M. incognita every 24 hours. The total RNA of M. incognita was extracted at the third day after M. incognita was adsorpted. Real time quantitative PCR was used to detect the expression of cyp-33、lin-45 and mek-2 gene. The authors confirmed that the purified nematode was M. incognita and the death rate of M. incognita significantly increased when infected by P. penetrans. At the same time the expression of life-related gene cyp-33 and reproduction-related genes lin-45 and mek-2 reduced at the beginning of adsorption comparing with the control group（p<0.05）. P. penetrans could reduce the lifespan and reproduction of M. incognita. The mechanism may be related to the regulation of cyp-33、lin-45 and mek-2 gene.

Key words ?Meloidogyne incognita; Pasteuria penetrans; Real time quantitative PCR; Survival rate

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.020

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是一類分布廣泛的植物寄生線蟲，對(duì)農(nóng)作物的危害非常嚴(yán)重。每年由于根結(jié)線蟲病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失在全球范圍內(nèi)高達(dá)數(shù)百億美元[1]。近年來(lái)，根結(jié)線蟲病的危害在國(guó)內(nèi)也愈演愈烈，其中分布最廣、危害最大的是南方根結(jié)線蟲[2-3]。穿刺巴斯德芽菌（Pasteuria penetrans）是根結(jié)線蟲的專性寄生菌，也是最具潛力的根結(jié)線蟲生防因子[4-5]。穿刺巴斯德芽菌的孢子能特異性吸附在根結(jié)線蟲體表，然后進(jìn)入線蟲體內(nèi)萌發(fā)，奪取線蟲體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)并在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育[6]。而根結(jié)線蟲由于穿刺巴斯德芽菌的侵入，生殖腺發(fā)育不完全，生殖系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，不能產(chǎn)卵或只能形成少量的卵，最終導(dǎo)致根結(jié)線蟲嚴(yán)重不育，線蟲的蟲口密度由此降低[7]。

目前對(duì)于穿刺巴斯德芽菌與根結(jié)線蟲互作的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，南方根結(jié)線蟲被穿刺巴斯德芽菌感染后線蟲基因表達(dá)水平的研究也未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲，探討線蟲被穿刺巴斯德芽菌吸附后存活率的變化，并在吸附初期收集線蟲總RNA，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)線蟲壽命相關(guān)基因cyp-33和生殖相關(guān)基因lin-45/mek-2的表達(dá)情況，為下一步研究穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲初期的轉(zhuǎn)錄組分析奠定基礎(chǔ)，也為將來(lái)探索根結(jié)線蟲的生物防治提供新思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

Taq DNA polymerase、Marker Trans 2K Plus等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA Marker DM2000購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒、DEPC購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司;RNeasy Plus Mini Kit 購(gòu)自Qiagen公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?穿刺巴斯德芽菌的收集 ? 采集已人工接種穿刺巴斯德芽菌和根結(jié)線蟲的番茄病根，用清水洗去附著的土壤后挑取病根根結(jié)中的雌蟲，置于1.5 mL離心管中，用1%的次氯酸鈉消毒5 min后，用無(wú)菌水漂洗3次，再用無(wú)菌鑷子壓破雌蟲，加入1 mL無(wú)菌水制成懸浮液，置于光學(xué)顯微鏡（400×）下觀察有無(wú)穿刺巴斯德芽菌的特征性孢子[7-9]。收集孢子樣品，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度，保存于4 ℃冰箱中待用[9]。

1.2.2 ?南方根結(jié)線蟲的采集和純化培養(yǎng) ? 從海南定安的胡椒園里采集帶有根結(jié)的胡椒根，在解剖鏡下用解剖針挑取單個(gè)卵塊，用1%的次氯酸鈉消毒后將卵塊置于清水中孵化，2 d后將孵化出的2齡幼蟲接種于預(yù)先培植于消毒土的番茄根部。接種50 d后拔出番茄苗，觀察番茄根部是否有根結(jié)、根結(jié)數(shù)目及是否有卵塊。當(dāng)根結(jié)上出現(xiàn)卵塊時(shí)，挑取成熟的根結(jié)線蟲卵塊，消毒后再次孵化轉(zhuǎn)接到番茄根部，以此擴(kuò)繁根結(jié)線蟲[10]。

1.2.3 ?根結(jié)線蟲分子鑒定 ? 收集由卵塊孵化出的2齡幼蟲，提取線蟲基因組DNA[11-12]。根結(jié)線蟲分子鑒定方法參照Meng等[13]的方法，選取MI-F/R、MJ-F/R、MT-R/MI-F 3對(duì)引物做PCR。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)采用50 μL體系：10×EasyTaq Buffer 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，EasyTaq DNA polymerase 1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 33 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物2 μL 用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶。

1.2.4 ?穿刺巴斯德芽菌體外吸附根結(jié)線蟲 ? 挑取40個(gè)根結(jié)線蟲卵塊放入1.5 mL離心管中，加入500 μL的無(wú)菌水吹打沖洗3次。加入1%的次氯酸鈉消毒5 min后，再用無(wú)菌水吹打沖洗3次。卵塊分裝至96孔板中，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵化。卵塊孵化48 h后，取孵化出的2齡幼蟲置于96孔板中，每孔60條左右，實(shí)驗(yàn)組每孔加10 μL（5.48×104個(gè)）穿刺孢子液，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱。12 d內(nèi)每隔24 h在顯微鏡下觀察根結(jié)線蟲并計(jì)數(shù)死亡和存活的線蟲條數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[15-16]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算各組線蟲的死亡率。

線蟲死亡率=■×100%

1.2.5 ?南方根結(jié)線蟲總RNA的提取 ? 在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲的第3天收集2齡幼蟲，同時(shí)收集未被穿刺巴斯德芽菌吸附的南方根結(jié)線蟲作對(duì)照，14 000 r/min 4 ℃離心10 min。用線蟲M9緩沖液（每升含15.12 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，0.12 g MgSO4）洗線蟲1次，14 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清。將蟲體轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的離心管中。按照試劑盒說(shuō)明書，用Qiagen的RNeasy Plus Mini Kit提取線蟲總RNA?？俁NA樣品放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 ?線蟲相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) ? 將根結(jié)線蟲的總RNA用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄得到線蟲的cDNA。Real time PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，使用2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒，在美國(guó)安捷倫Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系（20 μL）：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，DNF buffer 2 μL，PCR-grade water 5 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火50 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用2△△CT法對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2003處理后，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?根結(jié)線蟲鑒定結(jié)果

提取根結(jié)線蟲2齡幼蟲的基因組后，用3對(duì)引物（MI-F/R、MJ-F/R、MT-R/MI-F）對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物MI-F/R、MT-R/MI-F分別擴(kuò)出1 000、780 bp的條帶，而引物MJ-F/R未擴(kuò)增出條帶（圖1），據(jù)此可確定純化的根結(jié)線蟲為單一的南方根結(jié)線蟲[13]。

2.2 ?穿刺巴斯德芽菌對(duì)南方根結(jié)線蟲存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在清水中南方根結(jié)線蟲的死亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，在吸附的第3天實(shí)驗(yàn)組的南方根結(jié)線蟲死亡率達(dá)31.8%，對(duì)照組根結(jié)線蟲的死亡率為14.6%;到第4天實(shí)驗(yàn)組線蟲的死亡率是40%，對(duì)照組線蟲死亡率仍然是14.6%;到吸附的第12天實(shí)驗(yàn)組線蟲的死亡率是93.9%，對(duì)照組線蟲死亡率為53.2%。雖然2組線蟲的死亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈遞增趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組根結(jié)線蟲的死亡率一直高于對(duì)照組（圖2）。此外，在穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲的過(guò)程中，南方根結(jié)線蟲體表吸附的穿刺孢子個(gè)數(shù)在吸附初期與吸附時(shí)間呈正相關(guān)（圖3）。

2.3 ?南方根結(jié)線蟲總RNA的提取

提取的南方根結(jié)線蟲總RNA用1%的瓊脂糖凝膠， 在1×TAE電泳緩沖液中120 V電泳30 min，在紫外燈下檢測(cè)RNA條帶并拍照（圖4）。再取1 μL總RNA 用Nanodrop2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度（表2）。從圖4中可看出，提取的RNA完整性良好，濃度和質(zhì)量均達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 ?熒光定量PCR檢測(cè)基因cyp-33、lin-45和mek-2的表達(dá)情況

熒光定量PCR的溶解曲線峰形窄而尖，無(wú)雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。在熒光定量擴(kuò)增曲線上，基因指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期均十分明顯，線性范圍廣，表現(xiàn)為理想的擴(kuò)增曲線。熒光定量PCR結(jié)果的相對(duì)定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染了穿刺巴斯德芽菌后南方根結(jié)線蟲的壽命相關(guān)基因cyp-33和生殖相關(guān)基因lin-45/mek-2表達(dá)下調(diào)（圖5）。采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明：P（cyp-33）=0.001、P（mek-2）=0.005均小于0.01，差異極顯著;P（lin-45）=0.038小于0.05，差異顯著。綜上所述，被穿刺巴斯德芽菌感染初期的南方根結(jié)線蟲與對(duì)照組相比，cyp-33、lin-45和mek-2基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。

3 ?討論與結(jié)論

穿刺巴斯德芽菌是目前公認(rèn)的防治根結(jié)線蟲最有效的生物防治劑[17]。它不具有運(yùn)動(dòng)能力，當(dāng)根結(jié)線蟲的2齡幼蟲在土壤中運(yùn)動(dòng)時(shí)，觸碰到穿刺巴斯德芽菌的孢子，穿刺孢子表面的一些特殊蛋白能特異粘附在根結(jié)線蟲2齡幼蟲的表面，在某種酶的作用下，孢子的芽管會(huì)突破芽孢底部的粘著層并穿透線蟲表皮，伸入線蟲體內(nèi)[18]，奪取線蟲體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，降低線蟲的蟲口密度。蟲體死亡、裂解之后，成熟的孢子又重新釋放到土壤中，開(kāi)始新的侵染循環(huán)[17，19]。由于穿刺巴斯德芽菌防治根結(jié)線蟲高效無(wú)污染，因此，目前該方面研究備受關(guān)注[20-21]。

本研究在植物體外用穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲，觀察線蟲存活率及吸附初期壽命和生殖相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穿刺巴斯德芽菌吸附南方根結(jié)線蟲后能降低線蟲的存活率，壽命和生殖基因在吸附早期已經(jīng)下調(diào)表達(dá)。線蟲壽命相關(guān)基因cyp-33的上調(diào)能夠延長(zhǎng)線蟲壽命[22]，而穿刺吸附南方線蟲后線蟲存活率降低，cyp-33基因表達(dá)下調(diào)。這說(shuō)明穿刺巴斯德芽菌在感染南方根結(jié)線蟲后能夠降低線蟲的存活率，這可能與cyp-33的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確。線蟲生殖相關(guān)基因lin-45/mek-2是Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路中的2個(gè)重要成員，它能夠促進(jìn)排泄管、陰門細(xì)胞的發(fā)育，在線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要角色[14，23]，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穿刺菌吸附南方根結(jié)線蟲后線蟲的lin-45/mek-2基因表達(dá)均下調(diào)。何元等[6]研究發(fā)現(xiàn)，穿刺巴斯德芽菌吸附根結(jié)線蟲后的第7天，根結(jié)線蟲的生殖腺長(zhǎng)度只有對(duì)照線蟲的90%左右，且隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，線蟲的生殖器官發(fā)育更遲緩。這提示了被穿刺巴斯德芽菌吸附后根結(jié)線蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育受到抑制可能與Ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。但具體機(jī)制目前仍不明確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在本研究的基礎(chǔ)上，筆者們將運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析南方根結(jié)線蟲被穿刺巴斯德芽菌感染初期的轉(zhuǎn)錄組變化，從分子水平闡述二者的互作機(jī)制，為將來(lái)研究穿刺巴斯德芽菌與根結(jié)線蟲的互作和根結(jié)線蟲的防治提供新策略。

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