徐岷 王國英 趙義 蔡菁 倪鑫 劉鑫 張行行 張尤歷

·論著·

MicroRNA-429對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠胰腺星狀細(xì)胞活化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用

徐岷 王國英 趙義 蔡菁 倪鑫 劉鑫 張行行 張尤歷

目的探討miR-429對大鼠胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)活化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的調(diào)控作用。方法用組織塊法提取、培養(yǎng)和分離PSCs，通過免疫熒光染色法檢測結(jié)蛋白(desmin)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)鑒定PSCs。取新鮮分離的第2代PSCs，采用脂質(zhì)體法將miR-429的模擬物(miR-429 mimic) 和無意義小分子陰性對照片段(miR-NC)分別轉(zhuǎn)染大鼠PSCs，再用10 μg/L TGF-β1刺激PSCs。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞a-SMA、波形蛋白(vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cad)及EMT相關(guān)蛋白TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的表達(dá)量；實(shí)時熒光定量PCR法檢測a-SMA、vimentin、E-cad mRNA和miR-429的表達(dá)量。結(jié)果培養(yǎng)后PSCs細(xì)胞體積變大，偽足發(fā)達(dá)，細(xì)胞間連接減少，脂滴消失， GFAP、desmin 表達(dá)陽性，α-SMA表達(dá)陰性，符合星狀細(xì)胞的生物學(xué)特征。TGF-β1刺激后，大鼠PSCs α-SMA、vimentin、E-cad蛋白的表達(dá)量分別為對照組的(1.369±0.878)、(1.518±0.041)、(0.549±0.076)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-429 mimic且經(jīng)TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin、E-cad mRNA表達(dá)量是轉(zhuǎn)染miR-NC組的(0.423±0.038)、(0.652±0.043)、(2.235±0.045)倍，蛋白表達(dá)量是(0.683±0.053)、(0.548±0.049)、(1.548±0.038)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)；TGF-β/Smad通路的TGF-β1、p-Smad2/3的相對表達(dá)量是miR-NC組的(0.459±0.038)、 (0.525±0.029)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。結(jié)論上調(diào)miR-429的表達(dá)可減弱TGF-β1對大鼠PSCs活化的影響及逆轉(zhuǎn)EMT，其可能的機(jī)制是抑制TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

微RNAs； 轉(zhuǎn)化生長因子β1； 胰腺星形細(xì)胞； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞特征而獲得間質(zhì)細(xì)胞特征的轉(zhuǎn)化過程，它是可逆的[1]。在EMT時，細(xì)胞表面上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cad)表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，胞間連接被破壞，胞內(nèi)肌動蛋白骨架重構(gòu)[2-3]。EMT是胰腺纖維化過程的早期階段，而活化的胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)是胰腺纖維化的核心環(huán)節(jié)。研究表明，PSCs在靜息狀態(tài)下保持著上皮細(xì)胞的特征，激活后向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這一過程被認(rèn)為是 EMT 現(xiàn)象[4]。文獻(xiàn)報道，TGF-β1可刺激PSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞[5-6]。微小RNA(microRNA, miR)對EMT的調(diào)控作用亦越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，其中miR-200家族是最重要的一類[7]。本研究采用TGF-β1活化PSCs，將miR-429轉(zhuǎn)染PSCs，觀察miR-429轉(zhuǎn)染對TGF-β1刺激的大鼠PSCs活化和EMT修改蛋白表達(dá)的影響，探討miR-429調(diào)控EMT的機(jī)制。

材料和方法

一、原代PSCs分離和培養(yǎng)

苯巴比妥鈉腹腔注入麻醉SD雄性大鼠，75%乙醇消毒后于超凈臺內(nèi)快速分離出胰腺，去除周圍脂肪組織，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，加入少量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基均勻接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，更換培養(yǎng)基，以后每2～3 d更換培養(yǎng)基一次。培養(yǎng)24 h后組織塊周圍有細(xì)胞爬出，5～7 d細(xì)胞開始快速增殖，進(jìn)行傳代，取第二代PSCs作為研究對象。

二、免疫熒光染色法鑒定PSCs

將細(xì)胞均勻接種于24孔板，每孔1×103個細(xì)胞，貼壁后用4%多聚甲醛4℃固定過夜，0.3% TritonX-100處理8 min，加3% BSA 37℃孵育1 h，分別加抗α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscular actin,α-SMA)、結(jié)蛋白(desmin)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(gilal fibrillary acidic protein, GFAP)一抗，4℃過夜，加熒光標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，核熒光染色37℃ 30 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

三、TGF-β1刺激PSCs及miR-429轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期PSCs，以3×105個細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，貼壁后加入TGF-β1(終濃度為10 μg/L)刺激72 h，以未處理細(xì)胞作為對照。收集細(xì)胞備用。

取對數(shù)生長期PSCs，以每孔1×105個細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，加不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miR-429模擬物(miR-429 mimic，廣州銳博生物公司合成)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染無意義小分子片段(miR-NC)作為陰性對照，按試劑盒說明書操作。miR-NC及miR-429 mimic用量為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染24 h后加入TGF-β1(終濃度為10 μg/L)刺激48 h，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞形態(tài)，并收集細(xì)胞備用。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，裂解液裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測α-SMA、E-cad、vimentin、TGF-β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表達(dá)。抗α-SMA、E-cad、vimentin單抗購自英國Abcam公司，抗TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3單抗購自美國Cell Signaling Techmology公司，最后ECL化學(xué)發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影。用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的蛋白與內(nèi)參條帶吸光度值比作為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

五、熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)

采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再行熒光定量PCR檢測α-SMA、E-cad、vimentin mRNA和miR-429的表達(dá)量。引物序列：β-actin上游5′- CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；α-SMA上游5′-CGATAGAACACGCATCATCAC-3′，下游5′-GCATAGCCCTCATAGATAGGCA-3′；vimentin上游5′-GGGAGGAGAGCAGGATTTCT-3′，下游5′-TCTTTTGGAGTGGGTGTCAAC-3′；E-cad上游5′-TCCTCCTGCTCCTACTGTTTCT-3′，下游5′-TCCACCTCCCTCTTCATCATAG-3′；miR-429及內(nèi)參U6引物由廣州銳博生物公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 10 s，40個循環(huán)。采用公式2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠PSCs的形態(tài)學(xué)改變及鑒定

培養(yǎng)1 d后，PSCs向四周伸出觸角，呈星形或梭形，胞核與胞質(zhì)比例較大，脂滴豐富，透光度好；培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞星形外觀最明顯；1周后體積變大，偽足增多，脂滴基本消失(圖1)。免疫熒光染色后鏡下見約90%的細(xì)胞desmin和GFAP陽性表達(dá)，而α-SMA幾乎不表達(dá)，符合星形細(xì)胞的細(xì)胞表型(圖2)。

二、PSCs α-SMA、vimentin、E-cad蛋白表達(dá)量的變化

TGF-β1刺激72 h后，PSCs的α-SMA、vimentin蛋白的相對表達(dá)量增加，分別為對照組的(1.369±0.878)、(1.518±0.041)倍，而E-cad蛋白的相對表達(dá)量下降，為對照組的(0.549±0.076)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。

三、PSCs miR-429表達(dá)量的變化

TGF-β1刺激組PSCs的miR-429表達(dá)量顯著下降，為對照組的(0.35±0.06)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 原代培養(yǎng)1(1A )、3(1B )、7d(1C)的PSCs(×100) 圖2 PSCs的α-SMA(2A)、desmin(2B)、GFAP(2C)蛋白表達(dá)(免疫熒光×100)

圖3 對照組(1)和TGF-β1刺激組(2)PSCs 的α-SMA、vimentin和E-cad蛋白表達(dá)

四、 miR-429轉(zhuǎn)染對經(jīng)TGF-β1刺激的PSCs的a-SMA、vimentin、E-cad mRNA和蛋白表達(dá)影響

轉(zhuǎn)染miR-NC并經(jīng)TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin、E-cad mRNA表達(dá)量分別為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的(0.959±0.154)、(1.105±0.135)、(1.105±0.382)倍，蛋白表達(dá)量分別為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的(0.983±0.045)、(0.897±0.038)、(0.926±0.325)倍，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-429并經(jīng)TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin mRNA表達(dá)量分別為轉(zhuǎn)染miR-NC并經(jīng)TGF-β1刺激組的(0.423±0.038)、(0.652±0.043)倍，蛋白表達(dá)量分別為(0.683±0.053)、(0.548±0.049)倍，均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01，圖4)；E-cad mRNA表達(dá)量為miR-NC組的(2.235±0.045)倍，蛋白表達(dá)量為(1.548±0.038)倍，均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01，圖4)。

圖4 未轉(zhuǎn)染組(1)、轉(zhuǎn)染miR-NC組(2)、轉(zhuǎn)染miR-429組(3)經(jīng)TGF-β1刺激后PSAs的α-SMA、vimentin、E-cad蛋白表達(dá)

五、miR-429轉(zhuǎn)染對經(jīng)TGF-β1刺激的PSCs TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染miR-429并經(jīng)TGF-β1刺激后，PSCs的TGF-β1和p-Smad2/3表達(dá)量分別為轉(zhuǎn)染miR-NC并經(jīng)TGF-β1刺激組的(0.459±0.038)、(0.525±0.029)倍，均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或<0.01，圖5)。

圖5 未轉(zhuǎn)染組(1)及轉(zhuǎn)染miR-NC(2)、miR-429(3)并經(jīng)TGF-β1刺激后PSAs的TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)

討 論

近年來大量研究揭示PSCs在胰腺慢性纖維化的進(jìn)程中具有重要作用，是多種誘因作用的靶點(diǎn)，激活的PSCs引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積，最終導(dǎo)致胰腺纖維化的形成[4, 8]。參與胰腺纖維化的細(xì)胞因子較多，目前起重要作用而且研究較多的主要是TGF-β1。研究表明，TGF-β1是一種重要的成纖維生長因子，具有刺激特定細(xì)胞分裂增殖的能力。TGF-β1可刺激PSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉淀于胰腺間質(zhì)中，促進(jìn)胰腺纖維化的發(fā)生；且TGF-β1能夠促進(jìn)肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，與胰腺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后PSCs的E-cad蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，而α-SMA和vimentin蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，提示TGF-β1可使PSCs由原來的上皮樣特性轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，即發(fā)生了EMT。

在多細(xì)胞生物中，miRNA 通過不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合到靶基因 mRNA的3′端非翻譯區(qū)的特異序列，抑制靶基因 mRNA的翻譯，同時伴隨靶基因mRNA水平的降低[9]。microRNA也被證實(shí)參與復(fù)雜的生理過程，如胚胎形成、器官發(fā)育和腫瘤的形成。外源性miRNA-200家族誘導(dǎo)E-cad的表達(dá)和EMT過程。相反，抑制miRNA-200家族表達(dá)可減少E-cad的表達(dá)量和增加間質(zhì)標(biāo)志物 vimentin、ZEB1和ZEB2的表達(dá)量[10]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-429后，PSCs的α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)量下調(diào)，而E-cad蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示miR-429可誘導(dǎo)活化的PSCs發(fā)生EMT。

研究發(fā)現(xiàn)，自分泌TGF-β1/ZEB/miR-200信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控著細(xì)胞在上皮細(xì)胞狀態(tài)和間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)之間轉(zhuǎn)化的可塑性，在ZEBs和TGF-β間是正相關(guān)，而在miR-200和TGF-β以及 TGF-β和miR-200之間是負(fù)相關(guān)[11]。TGF-β/Smad信號通路是促進(jìn)EMT的主要信號通路。TGF-β1和TGF-β2均可誘導(dǎo)大鼠NRK52E細(xì)胞的纖維形成和EMT的發(fā)生，其機(jī)制是通過下調(diào)miR-200a的表達(dá)，繼而影響Smad3的活性和基質(zhì)蛋白的表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-429 又經(jīng)TGF-β1刺激的PSCs的TGF-β1及p-Smad2/3的表達(dá)量較單純TGF-β1刺激的PSCs明顯減少，提示miR-429可抑制TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但miR-429是否通過抑制TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來逆轉(zhuǎn)活化的PSCs和EMT，還有待通過阻斷該通路觀察EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)來進(jìn)一步證實(shí)。

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(本文編輯：呂芳萍)

中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病學(xué)專業(yè)委員會學(xué)術(shù)年會暨第17次遼寧省醫(yī)學(xué)會消化病

專委會學(xué)術(shù)會議通知

由中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病學(xué)專業(yè)委員會主辦、遼寧省醫(yī)學(xué)會、沈陽醫(yī)學(xué)會和《中華胰腺病雜志》編輯部協(xié)辦，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院承辦的“中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病專委會學(xué)術(shù)年會暨第17次遼寧省醫(yī)學(xué)會消化病專委會學(xué)術(shù)會議(2015，沈陽)”將于2015年7月24至26日在沈陽召開。本次學(xué)術(shù)會議是中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病專委會成立以來的首次學(xué)術(shù)年會，將邀請國內(nèi)外胰腺疾病研究領(lǐng)域的著名專家，采用多學(xué)科協(xié)作(MDT)論壇的形式，針對胰腺疾病(重點(diǎn)是急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺腫瘤)基礎(chǔ)與臨床方面的新方法、新技術(shù)進(jìn)行交流，匯集消化內(nèi)科、消化內(nèi)鏡、胰腺外科、影像醫(yī)學(xué)、病理科、中醫(yī)科等多學(xué)科專家的經(jīng)驗(yàn)和研究進(jìn)展，系統(tǒng)介紹胰腺疾病的最新研究成果和診治新技術(shù)。會議期間，將討論定稿我國急性胰腺炎MDT診治共識意見，并成立胰腺病專委會的首屆青年委員會。屆時將邀請30余位國內(nèi)著名專家作專題報告或會議主持，誠摯邀請消化界及相關(guān)領(lǐng)域各位同仁參會。

一、征文內(nèi)容：胰腺疾病方面：(1)急性胰腺炎的病因、發(fā)病機(jī)制及臨床診治進(jìn)展；(2)慢性胰腺炎的病因、發(fā)病機(jī)制及臨床診治進(jìn)展；(3)重癥急性胰腺炎的診治進(jìn)展；(4)胰腺癌的病因、發(fā)病機(jī)制及臨床診治進(jìn)展；(5)胰腺囊性病變的病因、發(fā)病機(jī)制及臨床診治進(jìn)展。征文要求：征文要求800字左右的中文摘要，內(nèi)容包括目的、方法、結(jié)果和結(jié)論。并請注明作者姓名、單位、郵編及郵箱地址，文責(zé)自負(fù)。凡在國內(nèi)學(xué)術(shù)會議上或全國公開發(fā)行的刊物上發(fā)表過的論文不予受理。截稿日期：2015年6月30日。

二、會務(wù)費(fèi)：注冊費(fèi)400元/人。

三、參會代表授予國家I類繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分10分。

四、請于5月31日前將參會信息以傳真、電子郵件或信件形式寄至大會秘書處?；蛞允謾C(jī)短信形式告知大會秘書處。

五、大會秘書處: 沈陽市沈河區(qū)文化路83號沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

聯(lián)系人：李宏宇、杜奕奇、劉旭，郵編：110840，傳真：024-28851113

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Effect of miR-429 on TGF-β1 induced activation and regulation of epithelial mesenchymal transition in rat pancreatic stellate cells

XuMin,WangGuoying,ZhaoYi,CaiJing,NiXin,LiuXin,ZhangXingxing,ZhangYouli.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212000,China

ZHANGYou-li,Email:zjyouli1957@163.com

Objective To investigate the effect of miR-429 on activation of pancreatic stellate cells (PSCs) in rat and regulation of epithelial mesenchymal transition (EMT). Methods PSCs were isolated and cultured with tissue culture method and desmin, gilal fibrillary acidic protein (GFAP) and α smooth muscular actin (α SMA) were determined by immunofluorescence staining to identify PSCs. Freshly isolated PSCs of 2nd generation were used．MicroRNA-429 mimic or nonsense small molecular fragments (negative control, NC) were transfected into PSCs by liposomes. 10 μg/L TGF-β1 was applied to stimulate PSCs. The expression of α-SMA, vimentin, E-cad and EMT-related proteins, TGF-β1, Smad2/3, P-Smad2/3 protein was measured by Western blot. The expression of α-SMA, vimentin, E-cad mRNA and miR-429 was detected by quantitative real time PCR. Results After culture, the cell volume of PSCs increased, pseudopodia were developed, inter-cell connections were reduced, and lipid droplets disappeared. GFAP, desmin were positively expressed, and α-SMA was negatively expressed, which were consistent with PSCs biological properties. After TGF-β1 stimulation, the expression of α-SMA, vimentin, E-cad in rat PSCs was (1.369±0.878), (1.518±0.041), (0.549±0.076) folds higher than those in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). After miR-429 mimic transfection and TGF-β1 stimulation, the expression of α-SMA, vimentin, E-cad mRNA was (0.423±0.038), (0.652±0.043), (2.235±0.045) folds higher than those in miR-NC group, and the expression of proteins was (0.683±0.053), (0.548±0.049), (1.548±0.038) folds higher than those in miR-NC group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05 or <0.01). The relative expression of TGF-β1, p-Smad2/3 were (0.459±0.038), (0.525±0.029) folds of those in miR-NC group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05 or <0.01).Conclusions Over expression of miR-429 significantly attenuates the PSCs activation induced by TGF-β1, and reverse the process of EMT, and the mechanisms may be inhibiting the TGF-β/Smad signaling pathway mediated by TGF-β1.

MicroRNAs; Transforming growth factor-beta 1; Pancreatic stellate cells; Epithelial-mesenchymal transition

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.004

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131247)；鎮(zhèn)江市“169四期工程”科研項(xiàng)目

212000 江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

張尤歷，Email：zjyouli1957@163.com

2014-09-02)