花 莉， 解井坤， 朱 超， 易維潔

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

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微生物群落結(jié)構(gòu)與偶氮染料之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究

花 莉1， 解井坤1， 朱 超1， 易維潔2

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

為探究偶氮染料結(jié)構(gòu)與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，利用T-RFLP技術(shù)對(duì)經(jīng)不同偶氮染料馴化后的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析.通過(guò)分析表明,微生物群落經(jīng)過(guò)偶氮染料馴化后發(fā)生了較大演替，而且不同的偶氮染料對(duì)應(yīng)形成的微生物群落結(jié)構(gòu)也不相同.因此，偶氮染料的結(jié)構(gòu)對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)的形成起著重要作用，其經(jīng)偶氮染料馴化后都能形成與之相對(duì)應(yīng)的以優(yōu)勢(shì)種群為主、其它微生物種群為輔的復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu).采用典范對(duì)應(yīng)分析法(Canonial Correspondence Analysis，CCA)分析了不同馴化處理生境的相似度以及與變量因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)脫色率對(duì)樣本生境分布的貢獻(xiàn)率最大，Shannon多樣性指數(shù)的貢獻(xiàn)率最小.這說(shuō)明微生物群落結(jié)構(gòu)的形成取決于偶氮染料，經(jīng)過(guò)馴化處理更傾向于形成以優(yōu)勢(shì)種群為主的特定微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物群落多樣性在偶氮染料的脫色作用中不是主要的決定因素.

微生物群落； 脫色； 偶氮染料； 微生物燃料電池

0 引言

偶氮染料是一類由偶氮發(fā)色基團(tuán)(-N=N-)聯(lián)接的芳香類化合物，因其功能多樣而被廣泛地應(yīng)用于紡織、制革、塑料制造、印染、造紙、制藥和化妝品制造等產(chǎn)業(yè)[1,2].由于偶氮染料分子的高毒性和致癌性，其工業(yè)源排放對(duì)公共健康造成了極大地威脅[3,4].

偶氮鍵的斷裂是偶氮染料分子細(xì)菌降解的前提，細(xì)菌通過(guò)偶氮還原酶來(lái)轉(zhuǎn)移電子攻擊偶氮鍵使其斷裂[5].由于單一純種菌株只能對(duì)某一種或某一類偶氮染料表現(xiàn)出較好的脫色效果，故對(duì)于含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的偶氮染料廢水而言，其脫色作用并不明顯[6].

微生物群落中不同菌株所產(chǎn)生的酶的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)菌株，從而使微生物群落脫色偶氮染料的效果較之純培養(yǎng)菌株具有明顯的優(yōu)勢(shì)[7].目前，在微生物群落脫色偶氮染料的研究中，有關(guān)微生物群落多樣性以及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究正逐漸成為研究熱點(diǎn)[8].

然而，對(duì)于偶氮染料與微生物群落結(jié)構(gòu)之間是否存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系、不同的偶氮染料是否具有各自的特定高效脫色微生物群落等，在這方面的研究目前還鮮有報(bào)道.

本研究選用了6種不同的偶氮染料(如表1所示)，采用目前分子生物學(xué)中較為先進(jìn)的手段T-RFLP,對(duì)經(jīng)過(guò)不同偶氮染料馴化后的脫水污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并和可分離培養(yǎng)的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比，為構(gòu)建具有高效脫色偶氮染料的微生物群落提供了理論參考.

1 材料與方法

1.1 可分離培養(yǎng)的微生物群落

采取序批式間歇補(bǔ)料運(yùn)行方式,利用脫水污泥對(duì)甲基橙、甲基紅、金橙I、橙黃G、肼黃、茜黃素R鈉鹽以及它們的混合染料等進(jìn)行脫色.待染料脫色完全，將上清液倒掉，加入新的染料馴化.培養(yǎng)液進(jìn)行新一輪馴化.反應(yīng)器為模擬的Winogradsky柱，即高為99.0 cm，直徑為5.0 cm，厚度為1.0 cm的有機(jī)玻璃柱[9].

用無(wú)菌移液管吸取10 mL馴化污泥置于90 mL無(wú)菌水中(內(nèi)含玻璃珠)，移液管吹洗3次，搖動(dòng)10 min混合均勻，即為10-1濃度混合液；取10-1濃度的菌液1 mL于9 mL無(wú)菌水中，移液管吹洗3次，搖勻，即為10-2濃度菌液;同法依次稀釋到10-8.

從稀釋倍數(shù)為10-6、10-7、10-8等的試管中分別取0.5 mL菌液，涂布于固體分離培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)計(jì)數(shù)的菌種數(shù)以及每一菌種所具有的菌落數(shù)獲得可分離培養(yǎng)的微生物群落.

表1 選用偶氮染料

1.2 T-RFLP分析方法

(1)DNA提取

利用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的土壤DNA試劑盒,對(duì)經(jīng)不同偶氮染料馴化后的脫水污泥進(jìn)行DNA的提取.

(2)細(xì)菌16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行16SrRNA的基因擴(kuò)增.

25μL體系為：模版1μL，混合液12.5μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，無(wú)菌水9.5μL ddH2O，引物 (27F/1492R)各1μL.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min、94 ℃ 1 min、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，循環(huán)25次；72 ℃延伸1 min.所得PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，然后利用限制性內(nèi)切酶HhaI在37 ℃孵育3 h，最后將酶切后的樣品在65 ℃條件下處理20 min使限制性內(nèi)切酶失活.

利用ABI基因分析儀3130XL(生物系統(tǒng)，美國(guó))，對(duì)處理后的樣品進(jìn)行毛細(xì)血管凝膠電泳；利用Genemarker(HID V1.7)，分析毛細(xì)血管電泳后的基因片段的大小、高度、面積等;通過(guò)去除引物峰(小于50 bp的T-RFLP)和雜峰(相對(duì)豐度小于0.5%的T-RFLP),使得T-RFLP圖譜得到修正.

單個(gè)T-RFLP的相對(duì)峰面積按如下公式計(jì)算：

Ap=Ni/N×100

式中：Ni—單個(gè)T-RFLP的峰面積；N—總T-RFLP的峰面積.

T-RFLP用MiCA3 PAT分析后移交http://mica.ibest.uidaho.edu/pat.php，進(jìn)行進(jìn)一步地分析，再根據(jù)所得數(shù)據(jù)構(gòu)建微生物群落結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與討論

2.1 可分離培養(yǎng)的微生物群落的結(jié)構(gòu)

通過(guò)馴化后，從7個(gè)Winogradsky柱中分離出來(lái)9種細(xì)菌，并通過(guò)DNA序列分析和生理及形態(tài)觀察對(duì)所得細(xì)菌進(jìn)行了命名.每個(gè)柱中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)分布圖見(jiàn)圖1所示.

PseudomnonasgeniculatestrainKa38(變形菌門) 是甲基橙脫色過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌，占可分離培養(yǎng)細(xì)菌的50%;對(duì)于甲基紅、金橙I、茜黃素R鈉鹽而言，Bacilluscereusstrain1FFF (厚壁菌門)是其優(yōu)勢(shì)菌，所占比例分別為30.4%、60%、38.63%，其次是KlebsiellavariicolastrainRVEV3 (變形菌門) 和ExiguobacteriumaestuariistrainYS-6 (厚壁菌門);橙黃G、肼黃、混合染料的優(yōu)勢(shì)菌為KlebsiellavariicolastrainRVEV3 (變形菌門),所占比例分別為31.82%、37.04%、34.63%,其次是ExiguobacteriumaestuariistrainYS-6 (厚壁菌門)和Bacilluscereusstrain1FFF (厚壁菌門).

圖1 可分離培養(yǎng)的微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2 T-RFLP技術(shù)分析微生物群落

分別從7個(gè)柱子中的馴化污泥中，提取基因組DNA用于T-RFLP分析.T-RFLP分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)馴化，每個(gè)柱子中都形成了各自獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，如圖2所示.

2.2.1 菌門水平

從菌門水平看，原始脫水污泥中含有13種菌門，其中，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門作為優(yōu)勢(shì)菌門，分別占有35.9%，17.7% 和17.6%，不可培養(yǎng)的菌群占有13.2%.經(jīng)過(guò)偶氮染料馴化后，微生物群落發(fā)生了明顯的演替，不可培養(yǎng)的菌群在所有的柱子中都占有了較大比例.

除了不可培養(yǎng)的菌群之外，在經(jīng)過(guò)甲基橙、甲基紅、金橙I、茜黃素R鈉鹽和混合染料馴化后的微生物群落中，擬桿菌門成為優(yōu)勢(shì)菌門，其次為變形菌門和厚壁菌門(混合染料).然而，經(jīng)橙黃G和肼黃馴化過(guò)的菌門分布和其它處理具有明顯的不同.橙黃G對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，其次為擬桿菌門；肼黃對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門，其次為變形菌門.

從偶氮染料結(jié)構(gòu)方面可知，肼黃和橙黃G具有較為復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，而甲基橙、甲基紅、金橙I、茜黃素R鈉鹽結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，且擬桿菌門在其馴化的微生物群落中作為優(yōu)勢(shì)菌門出現(xiàn)，說(shuō)明擬桿菌門在結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的偶氮染料的脫色過(guò)程中起著重要作用.放線菌門和變形菌門則可能具有特異性的脫色肼黃和橙黃G的能力，從而為尋找高效脫色復(fù)雜結(jié)構(gòu)的偶氮染料的菌群提供了參考.

由于染料結(jié)構(gòu)的不同，相應(yīng)地在馴化過(guò)程中所形成的菌門結(jié)構(gòu)和豐度也各不相同.例如，甲基橙和甲基紅具有相似的分子結(jié)構(gòu)，在經(jīng)甲基橙和甲基紅馴化后的微生物群落具有相似的菌門結(jié)構(gòu).厚壁菌門同時(shí)出現(xiàn)于金橙I和橙黃G的馴化柱中，可歸因于在其分子結(jié)構(gòu)中都有萘環(huán)的出現(xiàn).和其它馴化處理相比，在橙黃G、茜黃素R鈉鹽、肼黃馴化柱中，變形菌門表現(xiàn)出了較大豐度.從三者的結(jié)構(gòu)上看，其具有相似的結(jié)構(gòu)，即分子上都連有兩個(gè)磺酸基團(tuán)，說(shuō)明變形菌門在含有磺酸基團(tuán)的偶氮染料的脫色過(guò)程中起著重要作用.而且，和單一染料的馴化相比，經(jīng)混合染料馴化后，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等的豐度都在一定程度上有所降低，可能是因?yàn)榛旌先玖系亩拘悦黠@高于單一染料，使得微生物的活性降低，從而使豐度下降[10].

2.2.2 種屬水平

在種屬水平，除不可培養(yǎng)的菌群外，原始脫水污泥中的優(yōu)勢(shì)菌種為Prevotella(擬桿菌門)，占有7.8%的比例，其次為Bacillus(厚壁菌門)占5.1%.經(jīng)過(guò)偶氮染料馴化后的微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化：對(duì)于混合染料，其優(yōu)勢(shì)種群為Clostridium(厚壁菌門，8.4%) 和Cytophaga(擬桿菌門，5.5%)；對(duì)于甲基橙，其優(yōu)勢(shì)種群為Flavobacterium(擬桿菌門， 7.9%)、Cytophaga(擬桿菌門，7.0%)、Capnocytophaga(擬桿菌門，6.1%)、Prevotella(擬桿菌門，5.4%)；對(duì)于甲基紅，其優(yōu)勢(shì)種群為Flavobacterium(擬桿菌門，10.4%)、Cytophaga(擬桿菌門，6.9%)、Chlorobium(綠菌門，6.8%)，Prevotella(擬桿菌門，6.0%)；對(duì)于金橙I，其優(yōu)勢(shì)種群為Prevotella(擬桿菌門，28.9%)、Bacteroides(擬桿菌門，8.5%)；對(duì)于橙黃G，其優(yōu)勢(shì)種群為Neisseria(變形菌門，6.9%)、Marinobacter(變形菌門，5.1%)；對(duì)于茜黃素R鈉鹽，其優(yōu)勢(shì)種群為Cytophaga(擬桿菌門，7.7%)、Flavobacterium(擬桿菌門，5.1%)；對(duì)于肼黃，其優(yōu)勢(shì)種群為Microbacterium(放線菌門，12.7%).

由圖2可知，原始污泥的微生物群落多樣性明顯高于經(jīng)過(guò)偶氮染料處理的微生物群落.在種屬水平，和初始污泥相比，經(jīng)過(guò)馴化處理后的微生物種屬發(fā)生明顯的變化，而且不同的處理所得到的微生物群落結(jié)構(gòu)也有很大差異，這說(shuō)明在偶氮染料分子結(jié)構(gòu)上的微小變化能夠引起微生物群落結(jié)構(gòu)的較大改變[11].

并且在不同偶氮染料的馴化處理中，都能形成各自相應(yīng)的以豐度較大的優(yōu)勢(shì)種群為主的特定微生物群落結(jié)構(gòu).在所形成的微生物群落中,都有豐度較低種類各異的種屬存在，它們有的不參與偶氮染料的脫色，有的則參與偶氮染料的脫色并具有傳遞電子或產(chǎn)生誘導(dǎo)酶的作用.因此，由于微生物群落中微生物之間的協(xié)同作用，使得微生物群落較之純培養(yǎng)菌株，具有更為高效的脫色性能[12].

內(nèi)圓為菌門水平分布;外圓為種屬水平分布

2.3 典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)

采用典范對(duì)應(yīng)分析法(Canonial Correspondence Analysis，CCA)[13]，分析了不同馴化處理生境的相似度以及與變量因子的關(guān)系.排序中，變量因子包括pH、COD、脫色率(Decolorization Rate)、均勻度(Eveness)和Shannon多樣性指數(shù)[14](Shannon Diversity Index)等5個(gè).CCA排序采用國(guó)際通用軟件CANOCO4.5完成.

采用CCA對(duì)所研究的原始和7個(gè)馴化處理樣本，以及5個(gè)變量因子等進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析(如圖3所示).箭頭表示變量因子；箭頭連線的長(zhǎng)短表示不同變量因子對(duì)不同樣本生境相似度分布的貢獻(xiàn)大小，即相關(guān)性大小;箭頭連線與排序軸夾角的大小表示變量因子與排序軸相關(guān)性的大小，夾角越小說(shuō)明關(guān)系越密切;箭頭所處的象限表示變量因子與排序軸之間的正負(fù)相關(guān)性[15].

與第一排序軸相關(guān)系數(shù)較高的是第一次脫色率(1st DCr)、第二次脫色率(2nd DCr)、初始pH(pHi)、末端pH(pHe)、初始COD(CODi)、末端COD(CODe)、Shannon指數(shù)，表明在不同的pH條件下微生物對(duì)偶氮染料的脫色、COD的去除等表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生理生化代謝強(qiáng)度，同時(shí)在馴化后微生物的多樣性也有所增加.

與第二排序軸相關(guān)性較高的是均勻度(eveness)，說(shuō)明第二排序軸自下而上反映了不同處理樣品所形成的均勻度增加.較之第二排序軸，第一排序軸對(duì)樣本生境的影響較大.同時(shí),由箭頭的長(zhǎng)短可知，對(duì)樣本生境相似度分布貢獻(xiàn)較大的是脫色率和初始pH，其次是末端pH(pHe)、初始COD(CODi)、末端COD(CODe)和均勻度(eveness)，而Shannon多樣性指數(shù)的貢獻(xiàn)率則最小，說(shuō)明經(jīng)過(guò)馴化處理后的樣品可能更傾向于形成具有特定優(yōu)勢(shì)種群的微生物群落結(jié)構(gòu)[16].

DCr=脫色率，pHi=初始pH，pHe=末端pH，CODi=初始COD，CODe=末端COD，Shannon=Shannon多樣性指數(shù)，CK=初始脫水污泥，D1-D7是經(jīng)不同偶氮染料馴化后的生境

圖4 種群分布和經(jīng)不同偶氮染料馴化后的生境之間CCA分析的雙軸圖

圖4表明了微生物群落分布和樣本生境的關(guān)系.微生物被分成5個(gè)組群，分別命名為組1、組2、組3、組4、組5等.其中,組群2反映了空白樣本生境的微生物群落組成；組群1處在多種偶氮染料馴化的樣本生境中具有最大的物種多樣性和種群密度，說(shuō)明其對(duì)于偶氮染料的存在具有較好的適應(yīng)能力，可能具有高效脫色偶氮染料的能力，這為尋找高效脫色偶氮染料的功能菌群提供了參考；組群3作為一個(gè)特殊的微生物群落,處在肼黃馴化處理的樣本生境中，和組1、組2表現(xiàn)出了較大的差異性，說(shuō)明經(jīng)肼黃的馴化改變了樣本的生境，使得其中的微生物向著適應(yīng)生境的方向演替，形成了具有肼黃特異性適應(yīng)性和脫色效能的微生物群落；另外，組群4和組群5可視為過(guò)渡性微生物群落，在微生物群落的演替過(guò)程中起著過(guò)渡性作用.

微生物群落的演替路線可能為:組2—組4—組1，組1—組5—組3.

3 結(jié)論

本研究采用分離培養(yǎng)技術(shù)和T-RFLP技術(shù)對(duì)偶氮染料馴化后的微生物群落進(jìn)行了分析.通過(guò)分離培養(yǎng)，得到了2個(gè)菌門的9種菌種，其數(shù)量和種類都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T-RFLP技術(shù).然而,自然界中的多數(shù)微生物不能被分離培養(yǎng)[17]，而且由于富集和分離的方法具有很強(qiáng)的選擇性，使得經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的微生物不能真實(shí)地反映出自然狀態(tài)下的微生物群落[18].

經(jīng)過(guò)偶氮染料馴化后的微生物群落發(fā)生了較大演替，和原始污泥相比，經(jīng)過(guò)馴化后的污泥中微生物群落的多樣性在一定程度上有所下降，然而脫色性能卻有所增強(qiáng).在馴化過(guò)程中，不可培養(yǎng)的微生物菌群快速增加，逐漸成為微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌種，可能是由于偶氮染料作為難降解的外源化合物改變了微生物生境，使得微生物產(chǎn)生變異從而適應(yīng)新的生存環(huán)境而具有脫色偶氮染料的能力.

從CAA分析可知，脫色率對(duì)樣本生境分布的貢獻(xiàn)率最大，從而也反應(yīng)了偶氮染料對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響；而Shannon多樣性指數(shù)的貢獻(xiàn)率較小，說(shuō)明經(jīng)過(guò)馴化處理更傾向于形成以優(yōu)勢(shì)種群為主的特定微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物群落多樣性在偶氮染料的脫色作用中不是主要因素.

由微生物種群分布于微生物生境的分布圖(如圖4所示)可知，組群1具有最大的種群密度和豐度，其集中分布于多種偶氮染料的生境中，其在偶氮染料的脫色過(guò)程中可能起著重要作用;經(jīng)過(guò)肼黃處理后的生境與其它生境相比，表現(xiàn)出了較大差異，經(jīng)過(guò)特異性的選擇作用形成了具有脫色肼黃能力的微生物種群組群3.

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The exploration of the relationship between azo dyesand microbial community structure

HUA Li1, XIE Jing-kun1, ZHU Chao1, YI Wei-jie2

(1.College of Resources and Environment, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this study the relationship between azo dyes structure and microbial community structure was explored and the microbial community structure in acclimated sludge of different azo dyes was analyzed using the T-RFLP technology.The analysis showed that the microbial community after domestication had a drastic shift,and different azo dyes corresponded to different microbial community structures.Therefore,the formation of the microbial community was depended on the structures of azo dyes.And a complex microbial community structure including the dominant population with a large abundance and other population with small abundance would form after acclimating by each of azo dyes.Also Canonial Correspondence Analysis (CCA) was used to analyze the relationship between the environment similarity after acclimating and variables.It had found that the decolorization rate had the most contribution rate for the environment distribution and the Shannon diversity index least,which indicated that the formation of the microbial community structure was determined by azo dyes,and the effect of the microbial community diversity may not be notable.

microbial community; decolorization; azo dyes; microbial fuel

2015-03-24

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK072); 陜西科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BJ12-29)

花 莉(1978-)，女，貴州興義人，副教授，博士，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)

1000-5811(2015)03-0001-06

X172

A