于 穎, 陸 萌, 羅 瑤, 付佳琪, 林文和, 張 杰, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)實驗教學(xué)中心, 四川 成都 610065)

微生物實驗教學(xué)中開設(shè)蛭弧菌形態(tài)觀察和動態(tài)觀察實驗研究

于 穎, 陸 萌, 羅 瑤, 付佳琪, 林文和, 張 杰, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)實驗教學(xué)中心, 四川 成都 610065)

用硝酸銀染色法對雙層平板培養(yǎng)法獲得的蛭弧菌進行染色,利用相差顯微鏡和CCD DP27數(shù)碼成像系統(tǒng)觀察并記錄到蛭弧菌形態(tài)和侵入大腸桿菌的過程以及蛭弧菌鞭毛的運動狀態(tài)。同時,通過提高蛭弧菌菌體濃度可觀察到蛭弧菌捕捉大腸桿菌的動態(tài)過程。該實驗讓學(xué)生更加清晰和直觀地觀察到菌體的形態(tài)及運動方式,激發(fā)對微生物實驗的熱情,促進創(chuàng)新性人才的培養(yǎng),也為微生物實驗教學(xué)平臺的建設(shè)起到一定的推動作用。

蛭弧菌； 雙層平板法； 相差顯微鏡； 硝酸銀染色； 動態(tài)觀察

20世紀(jì)60年代,Stolp和Petiold在土壤中發(fā)現(xiàn)了蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)[1]。它廣泛存在于自然界中,其突出的生物學(xué)特性為可以寄生并裂解沙門氏菌[2]、弧菌、埃希氏菌[3]等菌屬,并且對高濃度的宿主具有趨向性,可以有效地裂解水體中的一些常見病原菌[4],還可以緩解水中一些有害物質(zhì)的影響[5],因此蛭弧菌被作為一種“綠色”微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景[6-9],在畜禽養(yǎng)殖中對致病菌也起到了良好的裂解作用[10]。

為了提高學(xué)生學(xué)習(xí)微生物的興趣,更好地鍛煉實驗操作能力,我們首次在教學(xué)中開設(shè)了對蛭弧菌研究的相關(guān)實驗。通過雙層平板法觀察蛭弧菌裂解大腸桿菌后形成的噬菌圈和利用蛭弧菌對污水生物凈化效果的觀察實驗,讓學(xué)生親自驗證了蛭弧菌特有的生物學(xué)特性,即可以有效地清除裂解污水中細菌,起到良好的凈化作用[11]。為了讓學(xué)生能夠更直觀地觀察到蛭弧菌,用硝酸銀染法對其染色,在普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢可觀察到蛭弧菌顯微結(jié)構(gòu)和形態(tài)[12]。但受普通光學(xué)顯微鏡成像效果的影響,其觀察及拍照效果不很理想,學(xué)生自己尋找目標(biāo)有一定難度,而且不能觀察到其動態(tài)過程。因此,本文采用相差顯微鏡對蛭弧菌進行觀察,不僅可以更為清晰地觀察到制片固定后的形態(tài)結(jié)構(gòu),而且可以直接觀察蛭弧菌鞭毛游動以及捕捉大腸桿菌的實時動態(tài)畫面。該創(chuàng)新性實驗的開設(shè),極大地激發(fā)了學(xué)生對微生物實驗的熱情,拓寬了學(xué)生的實驗思路,有利于創(chuàng)新性人才的培養(yǎng),在高校本科微生物教學(xué)中值得推廣。

1 實驗材料

1.1 儀器及器材

(1) 儀器:奧林巴斯相差顯微鏡BX43型(CCD DP27數(shù)碼成像系統(tǒng))；生化培養(yǎng)箱LRH-250A型；電子天平BS224S型；高壓滅菌鍋LDZX-30KBS型；電熱干燥箱DHG-9240型；超凈工作臺SW-CJ-1F型；冰箱BCD-301型；高速離心機LR56495型。

(2) 器材:玻璃試管；培養(yǎng)皿；移液槍(5 mL、1 000 μL、50 μL、10 μL)；酒精燈；三角瓶；細菌過濾器。

1.2 菌種

大腸桿菌(E.coil)；蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)(蛭弧菌由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐恒教授課題組惠贈)。

1.3 培養(yǎng)基

(1) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高壓滅菌20 min。

(2) 雙層平板培養(yǎng)基:上層LB培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,酵母提取物1.5 g,NaCl 2.5 g,瓊脂4 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高壓滅菌20 min；下層瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121 ℃高壓滅菌20 min。

(3) LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0～7.2,121℃高壓滅菌20 min

1.4 試劑

(1) 媒染試劑A液:單寧酸5 g,FeCl31.5 g,蒸餾水100 mL,15 %福爾馬林2 mL,1% NaOH 1.0 mL。

(2) 媒染試劑B液:AgNO32 g,用蒸餾水100 mL溶解,再滴入濃NH4OH,使之成為很濃的懸浮液;再繼續(xù)滴加NH4OH,直到新形成的沉淀重新剛剛?cè)芙鉃橹?再將備用的10 mL的AgNO3慢慢滴入,出現(xiàn)薄霧但輕輕搖動后薄霧狀沉淀又消失,再滴入AgNO3直到搖動后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。

2 實驗方法

2.1 雙層平板法培養(yǎng)蛭弧菌

2.1.1 宿主菌的制備

將宿主菌大腸桿菌接種至LB斜面培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,吸取1 mL無菌水至斜面試管中,用接種環(huán)使菌苔分散乳化備用。

2.1.2 蛭弧菌的培養(yǎng)

將3 mL滅菌的上層半固體LB培養(yǎng)基放置室溫冷卻至約50 ℃,分別吸取0.2 mL大腸桿菌懸液和0.3 mL蛭弧菌懸液打入其中；混勻后迅速傾倒于已配置好的下層瓊脂培養(yǎng)基上；冷卻凝固后放于32 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng),24～120 h后觀察到透明圈即為長有蛭弧菌的噬菌斑。

2.1.3 蛭弧菌懸液制備

在1.5 mL EP管中加入1 mL無菌水,用接種環(huán)挑取蛭弧菌噬菌斑單斑培養(yǎng)基放于其中，在32 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h，12 000g離心2 min,得到蛭弧菌懸液備用。

2.2 蛭弧菌形態(tài)觀察

勾取上述培養(yǎng)好的蛭弧菌噬菌斑單斑,按上述方法制備蛭弧菌懸液，蛭弧菌在單極端長有一根長而粗的鞭毛,用硝酸銀法對其鞭毛進行染色；取100 μL蛭弧菌懸液滴加在載玻片上,均勻涂布后自然干燥；用媒染試劑A液覆蓋菌面,染色5 min,用蒸餾水沖洗；用幾滴媒染試劑B液沖去殘留水分,再滴加覆蓋菌面數(shù)秒至1 min；當(dāng)出現(xiàn)明顯淺褐色時立即用蒸餾水沖洗,自然干燥后用相差顯微鏡鏡檢,并利用CCD DP27數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照。

2.3 蛭弧菌動態(tài)觀察

滴加1滴蛭弧菌懸液于載玻片上,用鑷子取少許棉花(阻止蛭弧菌運動),小心蓋上蓋玻片,避免氣泡產(chǎn)生,用相差顯微鏡鏡檢,并利用CCD DP27數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝視頻。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛭弧菌噬菌斑的觀察

結(jié)果：與只加有大腸桿菌的陰性對照板相比,加入有蛭弧菌的雙層平板上出現(xiàn)明顯的透明噬菌斑。

3.2 顯微觀察蛭弧菌形態(tài)

用銀染法染色后,可以清晰地看到呈逗點狀的蛭弧菌,其后長有一根鞭毛(見圖1)。另外,還可以觀察到大腸桿菌被蛭弧菌“入侵”后、裂解之前的形態(tài)(見圖1)。其外露出來的一條“尾巴”即為蛭弧菌的鞭毛,但其菌體已進入到大腸桿菌菌體內(nèi)。

3.3 蛭弧菌動態(tài)觀察

利用相差顯微鏡對液態(tài)涂片進行觀察,不僅可以看到大腸桿菌在其中快速游動,而且還可以觀察到蛭弧菌端鞭毛在不斷地擺動(見圖2)。當(dāng)加大懸液中蛭弧菌的濃度后,還觀察到了蛭弧菌跟隨、捕食大腸桿菌的動態(tài)圖像(見圖3)。

4 結(jié)論

(1) 蛭弧菌呈單細胞結(jié)構(gòu),端生鞭毛,為逗點狀、桿狀或弧狀,而且是能夠通過細菌濾器的細菌。通過該創(chuàng)新實驗的學(xué)習(xí),糾正了學(xué)生在以往學(xué)習(xí)過程中普遍認為的所有細菌都不能通過細菌濾器的觀念。我們開發(fā)的蛭弧菌污水凈化實驗使學(xué)生了解到了雙層培養(yǎng)基的制作過程和應(yīng)用,認識到蛭弧菌對水體的凈化作用。蛭弧菌形態(tài)及動態(tài)觀察實驗不僅讓學(xué)生直觀地觀察到了細菌個體,而且觀察到了細菌的運動方式。通過這些綜合性實驗的訓(xùn)練,鍛煉了學(xué)生的動手能力和科研思路,而且與實際問題相結(jié)合,使學(xué)生學(xué)習(xí)更有針對性。

圖1 單蛭弧菌形態(tài)和蛭弧菌侵入大腸桿菌形態(tài)(100×10)

圖2 蛭弧菌連續(xù)運動

(2) 蛭弧菌大小為(0.3～0.6) μm×(0.8～1.2) μm[13],僅為大腸桿菌的1/4～1/3,一般要通過電子顯微鏡才能觀察到,但由于設(shè)備昂貴,制片要求較高,本科教學(xué)實驗室不具備開設(shè)觀察形態(tài)課程的條件。雖然普通顯微鏡通過銀染法可以觀察到蛭弧菌的形態(tài),但沒有相差顯微鏡清晰。本實驗利用操作相對簡單的銀染法染色,通過相差顯微鏡不僅可以觀察到蛭弧菌的形態(tài),還可以清楚地看到蛭弧菌侵入大腸桿菌后的菌體形態(tài)。在制片過程中需要注意,滴加蛭弧菌和大腸桿菌懸液并均勻涂開后要自然風(fēng)干,以免破壞蛭弧菌的鞭毛結(jié)構(gòu)。為了便于觀察，讓背景更為干凈,在滴加硝酸銀染色時,切不可停留時間過長。

(3) 制作了蛭弧菌和大腸桿菌的液態(tài)片,并觀察到蛭弧菌和大腸桿菌的運動過程。當(dāng)加大蛭弧菌濃度后,還觀察到了蛭弧菌跟蹤、捕食大腸桿菌的動態(tài)過程。利用相差顯微鏡、CCD DP27數(shù)碼成像系統(tǒng)和CellSens Entry配套軟件,學(xué)生可以在電腦屏幕上找尋到合適目標(biāo)并拍照或攝像。該軟件簡單易懂,適合在教學(xué)中使用。

該實驗的開設(shè),突破了原有高校本科生基礎(chǔ)實驗課程內(nèi)容一成不變的特點,使微生物實驗課程變得更為生動有趣,有助于培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)微生物的積極性,促進微生物實驗教學(xué)平臺的建設(shè)并更好地服務(wù)于學(xué)生。

References)

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Study on opening morphological and dynamic observation ofBdellovibrioin microbilolgy experimental teaching

Yu Ying, Lu Meng, Luo Yao, Fu Jiaqi, Lin Wenhe, Zhang Jie, Wang Hong

(Bioscience Experiment Teaching Center,School of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Microbiology experimental course plays an important role in microbiology teaching,focusing on training students’ practical abilities and skills. By silver nitrate staining method,theBdellovibriois stained, which was cultured in double plates. TheBdellovibriomorphology and process of invadingE.colicould be clearly observed and recorded using the CCD DP27 digital imaging system of BX43 phase contrast microscope. Furthermore,the motion ofBdellovibrioflagella are also observed using the system.The dynamic processes ofBdellovibriocapturingE.colicould be observed with the same method whenBdellovibriois increased the high concentration. Therefore,students are able to more clear and direct to observe morphology and moment ofBdellovibrio. The experiments can not only stimulate enthusiasm on microbial experiments,but also promote the cultivation of innovative talents, and contribute to the construction of experimental teaching platform for the Microbiology as well.

Bdellovibrio; inverted phase contrast microscope; silver nitrate staining method; dynamic observation

2015- 05- 13 修改日期：2015- 06- 05

四川省高等教育人才培養(yǎng)質(zhì)量和教學(xué)改革項目

于穎(1984—)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古赤峰，博士，實驗師，主要從事微生物實驗教學(xué)科研工作E-mail：yuyingsea@163.com

汪紅(1961—)，女，四川成都，大專，高級實驗師，主要從事微生物實驗的教學(xué)和科研工作.

E-mail：wh002008@163.com

X703.1

B

1002-4956(2015)10- 0064- 03