李鵬程，李 飛，宋亞輝，廖 然，周 理，葛 波

0 引 言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的3.2%。男性膀胱癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第7 位，女性排在第10 位，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)［1－2］。吡柔比星作為一種廣譜抗腫瘤藥，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，通過(guò)阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期，進(jìn)而殺滅癌細(xì)胞。近年來(lái)研究顯示Livin、Caspase-3 參與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的生物學(xué)行為關(guān)系密切［3－4］。隨著基因治療作為綜合治療的一個(gè)重要手段在臨床中受到越來(lái)越多的關(guān)注，探討與膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制具有重要的意義。本研究采用吡柔比星誘導(dǎo)膀胱癌EJ 細(xì)胞株，觀察吡柔比星對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株EJ 增殖情況、細(xì)胞周期的影響，及對(duì)相關(guān)基因Livin、Caspase-3 表達(dá)的影響，探討其可能的分子機(jī)制，為吡柔比星在臨床膀胱癌輔助化療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膀胱癌細(xì)胞EJ 細(xì)胞株購(gòu)于南京凱基細(xì)胞公司;吡柔比星為深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;1640 培養(yǎng)基為GIBICOL 公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)于GIBICOL 公司;RT-PCR 反應(yīng)體系購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;Livin、Caspase-3 及β-action 引物購(gòu)于博士德生物技術(shù)有限責(zé)任公司;抗Caspase-3 一抗(兔源性)、抗β-action 一抗(兔源性)及二抗(山羊抗兔)均為博士德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌EJ 細(xì)胞株置于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 將傳代的膀胱癌EJ 細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為1×105個(gè)/孔，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，按0、0.1、1、10 μg/mL 的終濃度加入吡柔比星，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 吡柔比星濃度分為0、0.1、1、10 μg/mL。取對(duì)數(shù)期膀胱癌EJ 細(xì)胞，按2000 個(gè)/孔細(xì)胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，分別加入上述不同濃度吡柔比星干預(yù)，0 μg/mL 吡柔比星中加入等量的培養(yǎng)液作為對(duì)照，每組設(shè)5 個(gè)平行孔。繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h進(jìn)行處理，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A 值)，計(jì)算增殖抑制率，公式如下:

增殖抑制率(%)=(對(duì)照A 值－各濃度吡柔比星A 值)/對(duì)照A 值×100%

1.5 RT-PCR 檢測(cè)Livin、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EJ 細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組加藥培養(yǎng)后，用Ultrapure RNA Kit(超純RNA 提取試劑盒)提取總RNA 后測(cè)定RNA 的濃度和純度，使用SuperRT cDNA Kit(SuperRT cDNA 第一鏈合成試劑盒)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(20 μL 反應(yīng)體系)，使用2×Taq MasterMix(含染料)試劑進(jìn)行擴(kuò)增(50 μL 反應(yīng)體系)。Livin 上游引物:5'-GGCTTCTTCCACACAGGC-3'，下游引物:5'-CTCCTGCACACTGTGGAC-3';Caspase-3 上游引物:5'-CTGCCGTGGTACAGAACT-3'，下游引物:5'-AGGTGCTGTGGAGTATGC-3';β-actin 上 游 引 物:5'-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3'，下游引物:5'-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3'。測(cè)定各個(gè)條帶的灰度值，Livin、Caspase-3 條帶的灰度值與其相應(yīng)的內(nèi)參β-actin 條帶的灰度值的比值，作為各組間相互比較的參數(shù)。

1.6 Western blot 檢測(cè)Livin、Caspase-3 蛋白以明確目標(biāo)產(chǎn)物 將不同濃度的吡柔比星(0、0.1、1、10 μg/mL)干預(yù)處理EJ 細(xì)胞24 h 后，收集培養(yǎng)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞離心后的體積(PCV)，每50 μL PCV 加入5 倍體積RIPA 裂解緩沖液(250 μL)，冰浴放置10 min，反復(fù)吹打混勻，待細(xì)胞裂解充分后收集細(xì)胞蛋白產(chǎn)物，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液在室溫下封閉2 h，1∶400 一抗4 ℃下孵育過(guò)夜，PBST 溶液洗滌后和濃度為1∶1000 的二抗(用HRP 標(biāo)記)在室溫下孵育1 h，用PBST 溶液洗滌，與發(fā)光試劑充分反應(yīng)后，應(yīng)用Kodak 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的吡柔比星作用后EJ 細(xì)胞形態(tài)變化 采用倒置顯微鏡下，對(duì)照組:膀胱癌EJ 細(xì)胞呈多邊形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞大小均一，輪廓清楚，核分裂象多見;0.1 μg/mL 的吡柔比星:膀胱癌EJ 細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了抑制，較對(duì)照組細(xì)胞稀疏，核分裂象減少，細(xì)胞尚飽滿;1 μg/mL 的吡柔比星:膀胱癌EJ 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯，其貼壁狀態(tài)比較差，細(xì)胞縮小變形，部分細(xì)胞變圓甚至凋亡;10 μg/mL 吡柔比星:膀胱癌EJ 細(xì)胞稀疏，細(xì)胞縮小變形明顯，折光性變強(qiáng)，細(xì)胞萎縮、碎裂，形成有膜包圍的含有核和細(xì)胞質(zhì)碎片的凋亡小體，活細(xì)胞明顯減少。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同濃度的吡柔比星作用后EJ 細(xì)胞形態(tài)(×400)Figure 1 The growth situation of the EJ cells which are influnced by different consistences of THP(×400)

2.2 不同濃度的吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞增殖活性的影響 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè):①與0 μg/mL 吡柔比星比，0.1、1、10 μg/mL 吡柔比星干預(yù)膀胱癌EJ 細(xì)胞24、48、72 h 后，細(xì)胞的增殖活性受到明顯的抑制，且各時(shí)間之間及各濃度之間A 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。②細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高，有明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系(P ＜0.05)。其中10 μg/mL 的吡柔比星組作用于膀胱癌EJ 細(xì)胞72 h 后的增殖抑制率最高，為(89.1±2.6)%。見圖2。

表1 不同濃度吡柔比星對(duì)膀胱癌EJ 細(xì)胞A 值的影響，n=5)Table 1 Influence of THP on absorbance value of EJ cells in different time points and concentrationsn=5)

表1 不同濃度吡柔比星對(duì)膀胱癌EJ 細(xì)胞A 值的影響，n=5)Table 1 Influence of THP on absorbance value of EJ cells in different time points and concentrationsn=5)

與0 μg/mL 吡柔比星比較，* P ＜0.05，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P ＜0.05

吡柔比星A 值濃度(μg/mL)24 h 48 h 72 h 0 0.72±0.07 0.96±0.05 1.24±0.08 011 0.1 000...643 147±±±000...000 442***000...652 945±±±000...000 444***###000...861 014±±±000...000 654***###

圖2 不同濃度的吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞增殖抑制率的影響Figure 2 Influence of THP in different concentrations on inhibition rate of EJ cells

2.3 不同濃度吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞周期的影響0.1、1、10 μg/mL 吡柔比星干預(yù)膀胱癌EJ 細(xì)胞24 h后，其G2/M 期細(xì)胞百分比［(18.11±2.33)%、(61.34±2.03)%、(89.07±2.95)%］較0 μg/mL吡柔比星明顯增加(P ＜0.05)。見圖3。

2.4 不同濃度吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞Livin、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平的影響 0.1、1、10 μg/mL吡柔比星干預(yù)EJ 細(xì)胞24 h 后，Livin mRNA 表達(dá)水平較0 μg/mL吡柔比星明顯降低(P ＜0.05)，而Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平較0 μg/mL 吡柔比星明顯升高(P ＜0.05)。見圖4，表2。

2.5 不同濃度吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞Livin、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響 0.1、1、10 μg/mL 吡柔比星干預(yù)EJ 細(xì)胞24 h 后，Livin 基因蛋白表達(dá)水平較0 μg/mL吡柔比星明顯降低，而Caspase-3 蛋白表達(dá)水平則明顯升高(P ＜0.05)。見圖5，表2。

圖3 吡柔比星對(duì)EJ 細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響Figure 3 The influence of THP on cell cycle of EJ cells

圖4 RT-PCR 檢測(cè)吡柔比星對(duì)Livin、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響Figure 4 The influence of THP on the expressions of Livin and Caspase-3 by RT-PCR test

圖5 Western blot 檢測(cè)吡柔比星對(duì)Livin、Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Western blot tests the influence of THP to the expression of Livin and Caspase-3

表2 吡柔比星對(duì)Livin、Caspase-3 mRNA 及Livin、Caspase-3 mRNA 蛋白表達(dá)的影響Table 2 The influence of THP on the expressions of Livin and Caspase-3

表2 吡柔比星對(duì)Livin、Caspase-3 mRNA 及Livin、Caspase-3 mRNA 蛋白表達(dá)的影響Table 2 The influence of THP on the expressions of Livin and Caspase-3

與0 μg/mL 吡柔比星比較，*P ＜0.05

吡柔比星濃度RT-PCRWestern blot(μg/mL)Livin mRNA Caspase-3 mRNALivin 蛋白 Caspase-3蛋白0 0.84±0.07 0.12±0.13 0.74±0.03 0.22±0.02 0.1 0.63±0.09* 0.31±0.08* 0.43±0.08* 0.41±0.07*1 0.44±0.06* 0.52±0.04* 0.26±0.06* 0.62±0.03*10 0.21±0.02* 0.75±0.01* 0.11±0.01* 0.90±0.06*

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的復(fù)發(fā)率及局部侵襲力，其組織學(xué)類型多來(lái)源于上皮組織，鱗癌與腺癌所占比例較?。?－6］。大多數(shù)淺表性膀胱癌可經(jīng)尿道切除術(shù)治愈，但術(shù)后50%～70%的患者容易復(fù)發(fā)，部分患者伴有惡性程度增加或浸潤(rùn)能力增強(qiáng)，在保留膀胱的膀胱癌術(shù)后進(jìn)行膀胱灌注治療是預(yù)防復(fù)發(fā)的重要措施。

吡柔比星是半合成蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，常用于膀胱灌注化療，它能迅速進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，阻止核酸的合成，使腫瘤細(xì)胞終止增殖直至死亡，具有很強(qiáng)的抗癌活性，其抗癌譜較廣，對(duì)移行上皮癌有易感性，對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)較強(qiáng)。研究證明吡柔比星比臨床常用的同類藥物療效高、不良反應(yīng)少，但目前對(duì)于其抗腫瘤的具體機(jī)制卻不太明確［7－9］。

細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要方式，凋亡過(guò)程受到許多調(diào)節(jié)因子的控制，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)防止細(xì)胞過(guò)度增殖并清除有害細(xì)胞，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和機(jī)體正常的生理功能。

Livin 是凋亡蛋白抑制因子家族成員之一，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，研究證實(shí)Livin 在許多惡性腫瘤中呈高度表達(dá)，包括泌尿系腫瘤［10－12］。Livin有2 個(gè)剪切異構(gòu)體，分別為L(zhǎng)ivin-α、Livin-β，相對(duì)分子質(zhì)量分別為39 000 和37 000。Caspase 是一類介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白家族，大多數(shù)刺激物是通過(guò)Caspase 的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)引起細(xì)胞的凋亡。有研究表明Caspase-3 是細(xì)胞凋亡中最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終都需要Caspase-3 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13－15］。Livin 直接或間接抑制Caspase-3 的表達(dá)，凋亡抑制與促進(jìn)失衡，可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一，Livin 與Caspase-3 之間的關(guān)系或許是膀胱癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)吡柔比星對(duì)膀胱癌EJ 細(xì)胞在增殖具有明顯的抑制作用，并且存在明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明吡柔比星可使膀胱癌EJ 細(xì)胞明顯的阻滯于G2/M 期。RTPCR 結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Livin 基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，而促進(jìn)凋亡的Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，其作用具有明顯的劑量關(guān)系。這可能與吡柔比星誘導(dǎo)膀胱癌EJ 細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其分子機(jī)制可能是吡柔比星下調(diào)了膀胱癌EJ 細(xì)胞中Livin 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)，通過(guò)Livin 與Caspase-3 之間的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)引起細(xì)胞的凋亡，而本實(shí)驗(yàn)隨后的Western blot檢測(cè)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Livin、Caspase-3 基因在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用，或許可成為膀胱癌診斷與治療研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。

綜上所述，吡柔比星能有效地抑制膀胱癌EJ 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能是抑制了其中Livin 基因的表達(dá)，上調(diào)Caspase-3 基因的表達(dá)，使得膀胱癌EJ 細(xì)胞的增殖、侵襲能力下降。為吡柔比星應(yīng)用于膀胱癌術(shù)后的灌注化療，提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 吳階平.吳階平泌尿外科學(xué)［M］.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2005:921-980.

［2］ 那彥群.中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南［M］.人民衛(wèi)生出版社，2013:20-58.

［3］ Myung DS，Park YL，Chung CY，et al.Expression of Livin in colorectal cancer and its relationship to tumor cell behavior and prognosis［J］.PLoS One，2013，8(9):e73262.

［4］ Yoon TM，Kim SA，Lee DH，et al.Expression of Livin and the inhibition of tumor progression by Livin silencing in laryngohypopharyngeal cancer［J］.In Vivo，2014，28(5):751-759.

［5］ 崔殿生，熊治國(guó)，魏少忠，等.保留膀胱術(shù)后綜合治療肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的臨床療效［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，4:606-608.

［6］ 程 文，徐 鋒，刑瀟瀟，等.310 例膀胱癌綜合治療病例的臨床分析［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(12):1282-1285.

［7］ Li Q，Xu T，Wang XF.Mechanism of intravesical instillation of pirarubicin for preventing recurrence of non-muscle invasive bladder Cancer［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2009，31(12):904-907.

［8］ Zheng SE，Xiong S，Lin F，et al.Pirarubicin inhibits multidrugresistant osteosarcoma cell proliferation through induction of G2/M phase cell cycle arrest［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33(6):832-838.

［9］ 歐俐蘋，杜紅飛，呂長(zhǎng)坤，等.吡柔比星通過(guò)PLCε-Bcl-2 通路抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，7:708-713.

［10］ Chen X，Wang T，Yang D，et al.Expression of the IAP protein family acts cooperatively to predict prognosis in human bladder Cancer patients［J］.Oncol Lett，2013，5(4):1278-1284.

［11］ Lee DH，Yoon TM，Kim SA，et al.Relationship between expression of Livin and the biological behavior of human oral squamous cell carcinoma［J］.Oncol Rep，2014，32(6):2453-2460.

［12］ 李鵬程，葛 波.Livin 與泌尿系腫瘤的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(7):772-776.

［13］ Dasmahapatra G，Almenara JA，Grant S.Flavopiridol and histone deacetylase inhibitors promote mitochondrial injury and cell death in human leukemia cells that overexpress Bcl-2［J］.Mol Pharmacol，2006，69(1):288-298.

［14］ Liu GH，Wang C，Ding ZY.Overexpression of the truncated form of Livin reveals a complex interaction with caspase-3［J］.Int J Oncol，2013，42(6):2037-2045.

［15］ Xu M，Xia LP，F(xiàn)an LJ，et al.Livin and caspase-3 expression are negatively correlated in cervical squamous cell cancer［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2013，34(2):152-155.