王蕾，張顯文，田保華，薛紹武＊

（1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

植物通過(guò)氣孔吸收CO2進(jìn)行光合作用，同時(shí)由于蒸騰作用不可避免的散失水分。植物可以根據(jù)外界環(huán)境條件調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度大小來(lái)調(diào)控水分的散失，同時(shí)又保證足夠CO2的吸收 保衛(wèi)細(xì)胞離子跨膜運(yùn)輸和有機(jī)溶質(zhì)含量的變化引起保衛(wèi)細(xì)胞膨壓和體積的變化，氣孔開(kāi)度也會(huì)隨之變化［2］。細(xì)胞質(zhì)鈣離子（Ca2＋）被公認(rèn)為是植物應(yīng)對(duì)各種脅迫刺激時(shí)重要的第二信使，它在植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用［3］。一般認(rèn)為，細(xì)胞響應(yīng)眾多外界脅迫刺激時(shí)主要是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)游離Ca2＋濃度（［Ca2＋］cyt）變化來(lái)調(diào)控，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞外Ca2＋的流入以及細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放，引起［Ca2＋］cyt的升高，繼而激活可以與Ca2＋結(jié)合的蛋白質(zhì)或酶，從而引起細(xì)胞反應(yīng)。在保衛(wèi)細(xì)胞中，［Ca2＋］cyt可以調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞離子通道和質(zhì)子泵的活性。［Ca2＋］cyt升高可以激活S－型陰離子通道和外向整流鉀（）通道，從而調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)［4－5］。

鈣依賴性蛋白激酶（calcium dependent protein kinase，CDPK），屬于Ser／Thr型蛋白激酶，分子量40～90 k Da，它有3個(gè)主要的功能區(qū)，其中一個(gè)是類似于Ca M的調(diào)節(jié)區(qū)，包含4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合4個(gè)Ca2＋［6］。CDPK與Ca2＋結(jié)合后，酶隨即被激活，從而引起下游反應(yīng)。CDPK作為鈣感受器在植物體內(nèi)分布廣泛，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［7］；在眾多激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，CDPK也是重要的調(diào)節(jié)因子［8］。擬南芥中有34個(gè)CDPK成員，CPK6和CPK3屬于CDPK家族的成員［9］。擬南芥CPK 6基因位于第二條染色體上。Xu等研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）體內(nèi)過(guò)表達(dá)CPK6后，響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的丙二醛含量低于野生型，脯氨酸的含量高于野生型，植株的抗旱、耐鹽脅迫的能力明顯提高，表明CPK6在應(yīng)對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫過(guò)程中起正調(diào)控作用。在脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MJ）誘導(dǎo)擬南芥氣孔關(guān)閉過(guò)程中，CPK6對(duì)陰離子通道和Ca2＋通透的非選擇性陽(yáng)離子通道（ICa）起著正調(diào)控作用［9－10］。同時(shí)，Ye等［11］研究表明CPK6參與了酵母誘導(dǎo)子（YEL）誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程。這些結(jié)果說(shuō)明CPK6是植物響應(yīng)生物和非生物脅迫誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子。擬南芥CPK 3位于第四條染色體上。CPK3也參與了ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程中，可以使Ca2＋激活的質(zhì)膜S型陰離子通道蛋白磷酸化［12］。但是CPK3在MJ和YEL誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉中不發(fā)揮作用，CPK3可能只在干旱誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程中起作用，在應(yīng)對(duì)生物脅迫中不起作用［12］。CPK6和CPK3參與了眾多信號(hào)分子通路中，在CO2信號(hào)通路中有何作用目前尚不清楚。本研究通過(guò)PCR技術(shù)建立了鑒定鈣依賴性蛋白激酶T-DNA插入突變體的快捷方法，并在此基礎(chǔ)上，研究了CPK6與CPK3是否參與到CO2的信號(hào)過(guò)程中，為進(jìn)一步研究CDPKs的功能提供一些線索。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其培養(yǎng)條件

擬南 芥 野 生 型 （Columbia-0，col-0），T-DNA 插 入 突 變 體cpk3-1（SALK-107620）、cpk6-1（SALK-093308）種子購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué) Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。種子先用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精加入體積系數(shù)0.1%Triton X-100消毒處理，然后將滅菌處理的種子種在盛有1／2 MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在冰箱4℃春化2 d后轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 d左右再轉(zhuǎn)移到土中放入生長(zhǎng)箱培養(yǎng)。生長(zhǎng)環(huán)境條件為（22±1）℃，16 h光照／8 h黑暗，相對(duì)濕度70%－90%。

1.2 主要試劑

DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Taq Master Mix、DEPC、Tris等DNA和RNA提取試劑為上海生物工程公司產(chǎn)品，Taq DNA Polymerase，Real-time PCR試劑盒購(gòu)自 To KaRa公司，R Nasefree DNaseⅠ購(gòu)自 Thermo Scientific公司，MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，Trizol reagent RNA 提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 單株植物總DNA的提取

將擬南芥植株單株編號(hào)，參照并改良Edwards等［13］的方法，將DNA extraction buffer＋Nuclei lysis buffer＋5%sarkosyl（三者比例為1∶1∶0.4）＋0.02 mol／L的NaHSO3，混勻作為緩沖液混合物，65℃溫育并不斷搖晃，直至清亮透明。剪取4－5周大小的擬南芥葉1－2片于1.5 mL離心管中，加入200μL緩沖液混合物，用電鉆將葉片打碎后再加500μL緩沖液混合物。將打碎的葉片組織65℃溫育40～60 min，1次／10 min，輕輕顛倒混勻。加入750μL氯仿＋異戊醇（24∶1），混勻。10℃條件下，12 000 r／min離心8 min。轉(zhuǎn)移上清至一新的1.5 mL離心管中，加2／3－1體積的冷異丙醇，輕輕顛倒混勻。－20℃靜置30 min，10℃下，12 000 r／min離心10 min棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀。再在10℃下，12 000 r min離心2 min棄上清。在超凈臺(tái)中風(fēng)干，并加入滅菌的dd H2O溶解DNA。4℃溶解后，－20℃保存作為PCR擴(kuò)增的DNA模板。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

采用三引物PCR法，以提取的單株植物總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 2μL、2×Taq Master Mix 10μL、0.1 mmol／L引物2μL加dd H2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s，58.8℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸7 min，4℃保存。

純合植株獲得基因型鑒定所用的引物序列分別為：Salk＿LBb1.3：（LB1.3）5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’；cpk3-1：（P31）5’-CTCGTTCCACCACATCTAC-3’（P32）5’-AATTCCCCTCCTTCACACA-3’；cpk6-1：（P63）5’-CCGCGTAAAAGACCTTTCTTC-3’（P64）5’-AGCATAGTCAACACCTGTGGC-3’。

1.5 總RNA的提取和RT-PCR

液氮研磨組織葉片，每個(gè)1.5 m L樣品管分裝0.1 g組織樣品；每管加入1 m L Trizol試劑，迅速混勻；室溫下靜置5 min；加入200μL的氯仿，劇烈震蕩搖晃15 s，室溫下靜置5 min左右；12 000 r／min離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，加0.5 m L異丙醇，混勻，－20℃下沉淀10 min；12 000 r／min離心15 min；棄去上清，加1 m L 75%乙醇清洗RNA，振蕩片刻后，7 500 r／min離心5 min，小心棄上清；可重復(fù)此操作，確保沉淀中的乙醇被清洗干凈，室溫靜置5～15 min，使RNA沉淀恰好干燥，加入20μL DEPC水溶解RNA，取2μL瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量與濃度，將剩余RNA保存于－20℃冰箱中備用。

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程和RT-PCR過(guò)程的操作均參照標(biāo)準(zhǔn)方法［14］。

反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行基因表達(dá)量檢測(cè)的引物序列分別為：TPC1：（PP01）5’-TTTGTTGATGTGCTGGTTGA-3’（PP02）5’-TAGAGCACGAAGAACACCGA-3’；ACA9：（PP03）5’-TTCATTCACTGGAAGGGAGC-3’（PP04）5’-CCAGTCACCATTCGTACCTT-3’；ACA11：（PP05）5’-ACCTACAGAAAGGGCGATAC-3’（PP06）5’-TGTAGCCACCATTAGGAAGA-3’；CAX1：（PP07）5’-TGACACTCGTTATCGCATTG-3’（PP08）5’-TATGGGTGTTGTATGCCTCA-3’；SLAC1：（PP09）5’-ATTCCACTTTCGCCGACATC-3’（PP10）5’-CTAGGGCAAGCCACAAGACA-3’；MRP5：（PP11）5’-CGCCGCAGTTACATTCGCTAC-3’（PP12）5’-ATTTGCCCAAGCCATCCACC-3’；AKT1：（PP13）5’-ACTACTTTTGGGTCCGATGC-3’（PP14）5’-TTGGGAGTGCATCAAGAGTT-3’；AKT2：（PP15）5’-GCTTCTTGTCCGTGAACCTA-3’（PP16）5’-GTAAGCAGTGAGGCCAAGAT-3’；KAT1：（PP17）5’-GAACCAGAACCTTTAGGGATT-3’（PP18）5’-TTCCAGCGGTTTCACTACTT-3’；KC1：（PP19）5’-TCGTGTAGCCGAACTCTTTA-3’（PP20）5’-GGAGCGGAATAGATGTTGGT-3’；KCO1：（PP21）5’-CACCTCCTCATCCGAGTAAA-3’（PP22）5’-AAGCTGAGATAACCGGCATT-3’；SKOR：（PP23）5’-ATGGCAACTGTTGGTTATGG-3’（PP24）5’-CCAATACACCGTGACAAACA-3’；GORK：（PP25）5’-GGAGTGATTGGTTTGCTTGT-3’（PP26）5’-TCGCAGCGGTTACTATGAGT-3’；ACTIN7：（PP27）5’-GGCCGATGGTGAGGATATTCAGCCACTTG-3’（PP28）5’-TCGATGGACCTGACTCATCGTACTCACTC-3’。

1.6 全葉片氣孔導(dǎo)度的測(cè)定

取生長(zhǎng)4周左右的植株，用光合分析儀（Li6400）對(duì)植物葉片進(jìn)行氣孔導(dǎo)度的測(cè)定，每1編號(hào)最少測(cè)3株幼苗，每個(gè)編號(hào)至少測(cè)3株野生型（Col）的植株作為對(duì)照，每株植株測(cè)1片葉。分別用不同CO2濃度處理每個(gè)葉片：400μL／L 0.5 h，800μL／L 1 h，100μL／L 0.5 h，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

1.7 CO2對(duì)離子通道編碼基因表達(dá)量的影響

分別選取400μL／L和800μL／L CO2環(huán)境下生長(zhǎng)的野生型植株和突變體cpk6-1、cpk3-1、cpk3-1／6-1植株葉片，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對(duì)四種材料中與離子通道相關(guān)的編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDPK功能缺失突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1純合株的鑒定

cpk6-1 T-DNA片段插入點(diǎn)在第二個(gè)外顯子上，在翻譯起始密碼子下游60個(gè)堿基對(duì)的位置，cpk3-1 T-DNA片段插入點(diǎn)在第一個(gè)外顯子上 圖1A 當(dāng)用引物組合LP＋RP進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，野生型植株（Col）目的基因的兩條染色體上都沒(méi)有T-DNA片段的插入，所以只有一條PCR產(chǎn)物帶；雜合體植株（heterozygous lines，HZ）目的基因的兩條染色體上有一條發(fā)生了T-DNA插入突變，所以也會(huì)產(chǎn)生一條分子量大小與LP＋RP擴(kuò)出的條帶分子量相同的產(chǎn)物帶；而純合體植株（homozygous lines，HM）目的基因的兩條染色體上都有T-DNA片段的插入，所以沒(méi)有產(chǎn)物帶產(chǎn)生。同理，當(dāng)用LB1.3＋RP進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，野生型植株沒(méi)有產(chǎn)物帶產(chǎn)生，而雜合體植株與純合體植株都有一條分子量大小相同的產(chǎn)物帶（圖1B）。綜合兩種引物對(duì)組合檢測(cè)結(jié)果，鑒定獲得純合體植株。

Fig.1 T-DNA insertion sites of cpk6-1 and cpk3-1（A）as well as detection with PCR （B）圖1 cpk6-1和cpk3-1 T-DNA插入位點(diǎn)以及PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 Compare the stomatal conductance of mutants cpk6-1、cpk3-1 and cpk3-1／6-1 with col wild-type plant under different CO2 treatment圖2 不同濃度CO2 處理野生型（Col）與突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1氣孔導(dǎo)度變化

2.2 不同濃度CO2 處理突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1氣孔導(dǎo)度變化

為了觀察CDPK是否參與CO2的信號(hào)過(guò)程，我們測(cè)定了突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1在不同濃度CO2處理下的氣孔導(dǎo)度變化。從圖2中可以看出，野生型對(duì)照組與突變體測(cè)得的氣孔導(dǎo)度曲線軌跡相似，說(shuō)明在響應(yīng)不同濃度的CO2時(shí)，野生型和突變體cpk3-1、cpk6-1以及cpk3-1／6-1之間沒(méi)有明顯差異（P＝0.282（cpk3-1）；0.061 2（cpk6-1）；0.125（cpk3-1／6-1））。

2.3 CO2對(duì)離子通道編碼基因表達(dá)量的影響

已有研究表明［15］，高濃度CO2處理保衛(wèi)細(xì)胞可以激活陰離子通道電流。在此我們研究了野生型植物和突變體cpk6-1、cpk3-1以及cpk3-1／6-1在不同濃度CO2處理下，離子通道表達(dá)量的變化。在野生型和三種突變體中，內(nèi)向整流K＋通道（K＋in）編碼基因KAT1、AKT1、AKT2以及陰離子通道SLAC1與其調(diào)節(jié)因子編碼基因MRP5，外向整流K＋通道（K＋out）編碼基因GORK、KCO1，只有在不同CO2濃度處理后基因表達(dá)量表現(xiàn)出差異；相同CO2濃度處理?xiàng)l件下野生型和突變體之間沒(méi)有明顯差異。說(shuō)明不同濃度CO2處理影響了KAT1、AKT1、AKT2、SLAC1、MRP5、GORK、KCO1的表達(dá)量，然而CPK3和CPK6可能沒(méi)有參與CO2對(duì)上述通道基因的表達(dá)（圖3A）。

Ca2＋通道的編碼基因TPC1，Ca2＋-ATPase編碼基因及Ca2＋－H＋的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因ACA9、ACA11及CAX1 Kin通道編碼基因中KCl及Kout通道編碼基因中SKOR 在不同CO2濃度處理前后，野生型和突變體的表達(dá)量都沒(méi)有表現(xiàn)出差異。說(shuō)明TPC1、Ca2＋-ATPase、ACA9、ACA11、CAX1、KC1、SKOR的表達(dá)量不受CO2的影響，CPK3和CPK6對(duì)這些基因的表達(dá)也沒(méi)有影響（圖3B）。圖4表示在400μL／L和800μL／L CO2生長(zhǎng)條件下野生型和突變體cpk6-1、cpk3-1、cpk3-1／6-1植物離子通道相關(guān)基因的表達(dá)量的變化。結(jié)論與圖3一致。

Fig.3 Effect of CO2 on expression of ion channel-related genes Expression of potassium channel-related genes（A），anion channel-and calcium channel-related genes（B）affected by normal and high CO2 in the mutants and wild-type plants圖3 CO2對(duì)離子通道編碼基因表達(dá)量的影響

Fig.4 Relative expression level of ion channel-related genes under treatment with normal（N：400μL／L）and high（H：800μL／L）CO2圖4 不同濃度CO2對(duì)離子通道相關(guān)編碼基因表達(dá)量的影響（圖中數(shù)據(jù)來(lái)自圖3數(shù)據(jù)的分析。N：400μL／L CO2，H：800μL／L CO2）

3 討論

人們很早就認(rèn)識(shí)到低濃度CO2誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放，高濃度CO2誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，但是直到近些年來(lái)才逐漸發(fā)現(xiàn)參與CO2調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的基因。發(fā)現(xiàn)參與CO2調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的基因是H T 1（HIGH LEAF TEMPERATURE 1），它編碼一種蛋白激酶。在功能缺失的突變體ht1中，葉片氣孔對(duì)CO2反應(yīng)超敏感，表明HT1是CO2信號(hào)中負(fù)調(diào)控因子 Hu等 研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶CA1和CA4是高濃度CO2誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程中的上游調(diào)節(jié)因子。CPK3和CPK6在激素ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定葉片氣孔導(dǎo)度應(yīng)對(duì)不同濃度CO2的變化，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CPK3和CPK6參與調(diào)節(jié)高濃度CO2誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程。

當(dāng)植物受到生物和非生物刺激時(shí)，植物細(xì)胞能夠感受這些刺激并做出響應(yīng)，多數(shù)可以通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中游離Ca2＋濃度變化傳遞信號(hào)。氣孔運(yùn)動(dòng)主要由保衛(wèi)細(xì)胞膨壓變化控制的，保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上離子通道的活動(dòng)控制著膨壓的變化［2］。保衛(wèi)細(xì)胞通道電流、陰離子通道電流都受到胞質(zhì)Ca2＋的調(diào)控［17－18］。當(dāng)保衛(wèi)細(xì)胞受到高濃度CO2和碳酸氫根誘導(dǎo)后，胞質(zhì)Ca2＋升高，激活慢型陰離子通道，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉［18－19］。在氣孔開(kāi)放過(guò)程中，質(zhì)膜H＋-ATPases能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的H＋泵至胞外，質(zhì)膜超極化所產(chǎn)生的電化學(xué)梯度作為動(dòng)力驅(qū)動(dòng)K＋、Cl－、NO3－和 Malate2－進(jìn)入胞內(nèi)，使保衛(wèi)細(xì)胞的膨壓升高，氣孔開(kāi)放［20，21］。然而，低濃度CO2誘導(dǎo)氣孔開(kāi)放的機(jī)制目前還不清楚。由于離子通道的活動(dòng)與氣孔運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，因此研究了不同濃度CO2生長(zhǎng)條件下植物離子通道的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并且試圖解析CPK3和CPK6是否影響CO2對(duì)離子通道的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的CO2處理植物在轉(zhuǎn)錄水平影響了離子通道相關(guān)基因的表達(dá)，然而CPK3和CPK6沒(méi)有參與該過(guò)程。

擬南芥中CDPKs家族有34個(gè)成員，研究其他成員的功能是未來(lái)需要探討的課題。

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