賴(lài)滿(mǎn)香，楊　麗，張榮華△(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州5050;暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州5063)

梓醇對(duì)OB-OC共育體系中OB、OC活性及OB ERα、β mRNA表達(dá)的影響*

賴(lài)滿(mǎn)香1，2，楊麗2，張榮華2△
(1廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520;2暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510632)

［摘要］目的:觀察中藥單體梓醇在成骨-破骨共育體系中對(duì)成骨細(xì)胞( OB)增殖、OB堿性磷酸酶( ALP)活性、破骨細(xì)胞( OC)活性及OB雌激素受體( ER)α及β mRNA表達(dá)的影響，從細(xì)胞水平闡釋其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。方法:分別選取1 d和5 d SD大鼠分離培養(yǎng)OB和OC，并建立OB-OC共育體系;在共育體系中，用MTT法檢測(cè)低濃度( 0. 05、0. 1、0. 5、1 mg/L)、中濃度( 2、5、10 mg/L)和高濃度( 20、50和100 mg/L)梓醇干預(yù)下的OB增殖率，并以梓醇最佳促OB增殖濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和梓醇組。pNPP法檢測(cè)各組OB的ALP活性;光鏡觀察OC骨吸收陷窩數(shù)目;重氮鹽法檢測(cè)OC抗酒石酸酸性磷酸酶( TRAP)的活性; RT-PCR方法檢測(cè)OB ERα 及ERβ mRNA的表達(dá)。結(jié)果:在OB-OC共育體系中，0. 05～2 mg/L梓醇各組中OB的增殖率顯著高于對(duì)照組( P＜0. 01)，且0. 05 mg/L梓醇組促進(jìn)OB增殖的能力明顯高于其它濃度組( P＜0. 01)，5～100 mg/L梓醇各組OB的增殖率與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異( P＞0. 05)。0. 05 mg/L梓醇組的ALP水平高于對(duì)照組( P＜0. 05)，并在作用48、72和96 h后均對(duì)OC骨吸收陷窩數(shù)及TRAP有明顯抑制作用( P＜0. 01) ; 0. 05 mg/L梓醇組OB中ERα mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05)，而ERβ mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組( P＜0. 05)。結(jié)論:梓醇在共育體系中可提高OB增殖和成骨活性，抑制OC活性并上調(diào)OB中ERβ mRNA的表達(dá)。

［關(guān)鍵詞］梓醇;成骨細(xì)胞;破骨細(xì)胞;雌激素受體

梓醇屬環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，是地黃的主要有效成分之一［1］。以往藥理研究表明，梓醇能重現(xiàn)地黃抗腫瘤、抗衰老、降血糖等作用［2］。最近有文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，梓醇能促進(jìn)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖和分化，不同濃度梓醇能促進(jìn)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化，這與地黃的提取物具有促進(jìn)成骨細(xì)胞( osteoblasts，OB)增殖分化，抑制破骨細(xì)胞( osteoclasts，OC)抗酒石酸酸性磷酸酶( tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)活性，降低OC骨吸收陷窩數(shù)量，對(duì)骨質(zhì)疏松癥( osteoporosis，OP)有一定的防治作用相一致［5］?？紤]到OP的發(fā)病機(jī)制主要是由于OC介導(dǎo)的骨吸收和OB介導(dǎo)的骨形成之間的平衡失調(diào)所致，因此，本實(shí)驗(yàn)在體外建立OB與OC共育體系，觀察中藥單體梓醇在共育體系中對(duì)OB增殖、OB堿性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP)活性、OC活性及OB雌激素受體( estrogen receptor，ER)α 及β mRNA表達(dá)的影響，為梓醇防治OP的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1材料

1.1動(dòng)物普通級(jí)1日齡和5日齡SD新生大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為2006B008。

1.2藥物梓醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于廣東省藥品檢驗(yàn)所。1.3主要試劑低糖DMEM培養(yǎng)基( Gibco)，小牛血清( PAA)，0. 25%胰蛋白酶( Amersco)，Ⅱ型膠原酶( Sigma)，RT-PCR檢測(cè)試劑盒( TaKaRa)，TRIzol ( Investrigen)，DNA Marker( MBI)。

1.4主要儀器超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品)，倒置相差顯微鏡( Nikon)，CO2培養(yǎng)箱( Thermo)，離心機(jī)( Sigma)，細(xì)胞培養(yǎng)板( Costar)，酶標(biāo)儀( Bio-Rad)，紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，PE9600基因擴(kuò)增儀( PE)，DY-W2型電泳儀(北京生化儀器廠(chǎng)) ; TIGER Gel凝膠分析儀( PE)。

2方法

2.1分離培養(yǎng)OB采用二次酶消化法。取1日齡新生SD大鼠6～10只消毒，取出頭蓋骨，放入盛有D-Hanks緩沖液的培養(yǎng)皿中，剔除附著的結(jié)締組織及骨膜，D-Hanks沖洗3次，至顱骨呈白色。在0. 25%胰蛋白酶消化液內(nèi)將顱蓋骨剪碎，在37℃條件下恒溫消化20 min，以清除纖維組織，棄去消化液。再用0. 1%Ⅱ型膠原酶37℃下消化60 min，不時(shí)振蕩，收集上清，1 000 r/min離心10 min，去上清，白色沉淀物即為OB。加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×109/L，將其接種于培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2、

37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min后，將培養(yǎng)瓶輕輕傾斜，用吸管吸出培養(yǎng)液至第2瓶培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)10min后，再同樣接種到第3瓶培養(yǎng)瓶中，可得到純度較高的OB。第2天換液，除去未貼壁的細(xì)胞。以后每2～3 d換1次液。

2.2分離培養(yǎng)OC采用機(jī)械分離法。取5日齡SD大鼠，75%乙醇中浸泡10 min。取出置培養(yǎng)皿中，分離四肢長(zhǎng)骨，置于冷D-Hanks緩沖液中。將分離出來(lái)的四肢長(zhǎng)骨盡量清除骨周軟組織后，立即置于冷DMEM分離液內(nèi)并用解剖刀將骨質(zhì)輕輕快速刮碎，用圓頭滴管反復(fù)吹打2 min，使貼附在骨基質(zhì)上的OC脫落下來(lái)，直至骨內(nèi)表面變白為止，靜置1 min。懸液用DMEM培養(yǎng)液稀釋到所需密度( 4× 109/L)，按要求接種到有蓋玻片或骨片的培養(yǎng)板孔內(nèi)。置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，吸去培養(yǎng)液，再用預(yù)溫的培養(yǎng)液沖掉未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)以備活體觀察、細(xì)胞染色或用于共育。

2.2.1 兩組治療RAU總有效率的比較 共納入12篇文獻(xiàn)，合計(jì)有效率治療組為89.89%（880／979），對(duì)照組為 75.13%（580／772），I2＝52%，采用隨機(jī)效應(yīng)模型機(jī)型分析，有效率的 RR合并值為1.21，95%CI：1.14～1.29，兩組之間治 RAU總有效率的總效應(yīng)Z＝6.62，P＜0.001，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

2.3OB-OC共育體系的建立對(duì)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行改裝，在距培養(yǎng)孔底部2 mm的地方打孔，使相鄰的4孔間相通，中間加1層0. 45 μm的微孔濾膜，膜與培養(yǎng)板接觸處用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的瓊脂糖凝膠密封。將制備好的培養(yǎng)板置于紫外線(xiàn)燈下照射消毒，備用。以每孔5×104的密度將OB接種到OB培養(yǎng)室內(nèi)，以每孔5×104的密度將OC接種到OC培養(yǎng)室內(nèi)，每20 min觀察1次OC貼壁情況，同時(shí)觀察是否有細(xì)胞透過(guò)微孔濾膜進(jìn)入OC培養(yǎng)室。

2.4MTT法測(cè)定OB增殖率取培養(yǎng)好的第3代OB以每孔3×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3 h后，將新分離的OC以每孔3×104接種于OC培養(yǎng)室; 24 h后換入無(wú)血清培養(yǎng)液，待細(xì)胞周期同步化24 h后，更換為不同濃度的梓醇培養(yǎng)液。各劑量組的終濃度分別為低濃度組( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)、中濃度組( 2、5和10 mg/L)和高濃度組( 20、50和100 mg/ L)。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。僅加DMEM完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照組。分別培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)液，DHanks液沖洗3次，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基400 μL，同時(shí)每孔加入5 g/L的MTT 80 μL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度( A)，波長(zhǎng)為570 nm。參比波長(zhǎng)為630 nm。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定梓醇的敏感藥物濃度。

2.5實(shí)驗(yàn)分組及處理取第3代OB以每孔5×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3h后，將新分離的OC以每孔5×104接種于OC培養(yǎng)室;待細(xì)胞周期同步化24 h后，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和梓醇組，其中對(duì)照組僅加DMEM完全培養(yǎng)液，梓醇組加入敏感藥物濃度梓醇。

2.6pNPP法檢測(cè)OB ALP活性各組加入相應(yīng)藥物7 d后，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液沖洗3次，每孔加入500 μL 0. 1% Triton X-100作用30 min，收集細(xì)胞裂解液，采用ALP試劑盒檢測(cè)其活性。用金氏單位( 100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位)表示，具體操作按試劑盒說(shuō)明。2.7光鏡觀察OC骨吸收陷窩數(shù)取第3代OB以每孔5×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3 h后，將新分離的OC以每孔5×104接種于OC培養(yǎng)室;待細(xì)胞周期同步化后，在已放入象牙薄片的OC室再分別加入敏感藥物濃度0. 05 mg/L的梓醇組及對(duì)照組，2～3 d換液1次。分別培養(yǎng)24、48和72 h，取出所有象牙薄片，在2. 5%戊二醛固定液中于4℃固定7 min，然后在0. 25% NH3·H2O溶液中超聲清洗1 min，共3次，經(jīng)系列乙醇脫水，自然晾干后，置甲苯胺藍(lán)染液中，室溫下染色3～4 min，蒸餾水清洗后于光鏡下對(duì)整張象牙薄片上的吸收陷窩進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

2.8重氮鹽法檢測(cè)OC TRAP活性各組加入相應(yīng)藥物后分別培養(yǎng)24、48和72 h，收集各組OC培養(yǎng)室上清液，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TRAP活性的檢測(cè)。

2.9RT-PCR檢測(cè)OB中ERα/β mRNA的表達(dá)各組加入相應(yīng)藥物進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板的底面時(shí)，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液沖洗3次，用0. 25%的胰蛋白酶將各孔中的OB消化下來(lái)，每孔加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞，根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。cDNA的合成采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系: 總RNA 2 μL、Oligo 2 μL、dNTP 2 μL、RNase-free ddH2O 7. 5 μL置PCR儀上70℃5 min，后立即于4℃冰浴3 min，再依次加入5×Buffer 4 μL、RNasin 0. 5 μL、0. 1 mol/L DTT 1 μL、RIAScript M-MLV 1 μL 置PCR儀上42℃反應(yīng)50 min，90℃加熱5 min終止反應(yīng)，所得cDNA在－20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)總體系( 20 μL) : cDNA 2 μL、上游引物( 50 μmol/L) 1 μL、下游引物( 50 μmol/L) 1 μL、dNTPs ( 10 mmol/ L) 2 μL、10×PCR Bμffer 2. 5 μL、Taq酶( 5 U/μL) 0. 5 μL、ddH2O 11 μL，PCR程序: ERα和ERβ擴(kuò)增溫度參數(shù): 95℃，3 min; 95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);末次循環(huán)72℃5 min，4℃終止;β-actin擴(kuò)增溫度參數(shù):預(yù)變性95℃，3 min; 95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);末次循環(huán)72℃5 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，用凝膠圖像分析儀照相，BANDSCAN圖像分析軟件進(jìn)行灰度半定量分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間比較運(yùn)用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1共育體系中OB的形態(tài)

2共育體系中OC的形態(tài)

HE染色可見(jiàn)細(xì)胞呈油煎蛋形、長(zhǎng)條形、漏斗形或不規(guī)則形等多種形態(tài);胞體大，多核，一般為3～4個(gè)，染為藍(lán)紫色;胞質(zhì)少，染為淡紅色，或無(wú)色，見(jiàn)圖1B。這說(shuō)明所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)符合OC形態(tài)。

Figure 1.Morphology of OB and OC.A: OB 2 d after inoculation (×100) ; B: HE staining of OC (×400).圖1　OB和OC的形態(tài)

3梓醇對(duì)OB增殖的影響

在OB-OC共育體系中，各個(gè)濃度的梓醇對(duì)OB干預(yù)后，其A值均高于對(duì)照組，其中低濃度( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)梓醇組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)，組內(nèi)各濃度通過(guò)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中濃度( 2、5和10 mg/L)梓醇組與對(duì)照組比較，其中2 mg/L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而5和10 mg/L差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)各濃度通過(guò)兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度的梓醇組( 20、50、100 mg/L)與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　不同濃度梓醇對(duì)OB增殖的影響Table 1.Effect of different concentrations of catalpol on OB proliferation ( Mean±SD.n =6)

4梓醇對(duì)OB ALP活性的影響

在共育體系中，梓醇組OB的ALP活性顯著高于對(duì)照組( P＜0. 01)，見(jiàn)表2。

表2　梓醇對(duì)OB ALP活性的影響Table 2.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on ALP activity of OB( King unit.Mean±SD.n =6)

5梓醇對(duì)OC骨吸收陷窩的影響

在共育體系中，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)象牙薄片上有大小不等的橢圓形、圓形、或不規(guī)則型的藍(lán)紫色骨吸收陷窩，邊界清晰。梓醇組骨吸收陷窩數(shù)明顯低于對(duì)照組( P＜0. 01)，見(jiàn)表3。

表3　梓醇對(duì)OC骨吸收陷窩的影響Table 3.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on bone resorption pitsof OC ( Mean±SD.n =6)

6梓醇對(duì)OC TRAP活性的影響

TRAP活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且梓醇組在作用48、72和96 h后，OC的TRAP活性均顯著低于對(duì)照組( P＜0. 05)，見(jiàn)表4。

表4　梓醇對(duì)OC TRAP活性的影響Table 4.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on TRAP activity of OC ( U/L.Mean±SD.n =6)

7梓醇對(duì)OB ERα/β mRNA表達(dá)的影響

梓醇組和對(duì)照組經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，均有目的基因ERα和ERβ的條帶，片段大小和預(yù)期產(chǎn)物相近;對(duì)照組ERα mRNA與梓醇組的目的基因無(wú)明顯差別，而對(duì)照組ERβ mRNA表達(dá)較梓醇組弱，見(jiàn)圖2。經(jīng)半定量分析，對(duì)照組的ERα mRNA的表達(dá)與梓醇組比較無(wú)顯著差別( P＞0. 05)，而梓醇組ERβ mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組( P＜0. 01)，見(jiàn)表5。這說(shuō)明梓醇在共育體系中可以上調(diào)OB中ERβ mRNA表達(dá)，而對(duì)ERα mRNA的作用不顯著。

Figure 2.Effect of catalpol on the expression of ERα/β mRNA.M: marker; 1，3，5，7:β-actin; 2，4: ERα; 6，8: ERβ; 1，2，5，6: catalpol group; 3，4，7，8: control group.圖2　梓醇對(duì)OB ER α、βmRNA表達(dá)的影響

表5　各組灰度半定量比值Table 5.Gray semi-quantitative ratio of different groups ( Mean ±SD.n =6)

討論

在正常生理?xiàng)l件下，骨組織中OB與OC間的功能活動(dòng)并不是相互孤立存在的，骨組織的代謝依賴(lài)這兩種細(xì)胞相互作用; OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收相互偶聯(lián)，使骨重建處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，從而維持機(jī)體骨量與骨密度的正常［6］。在骨重建過(guò)程中，OB與OC間的功能存在直接或間接的信號(hào)交流，其中OPG/RANKL/RANK軸對(duì)破骨細(xì)胞分化、成熟及骨吸收功能發(fā)揮著重要作用，是OB和OC之間信號(hào)交談的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［7］。在骨重建逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，即骨吸收向骨形成轉(zhuǎn)化過(guò)程中，OC分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子等是OB活化的關(guān)鍵［8］。本實(shí)驗(yàn)重視OB和OC兩者之間的相互作用，采用平面式OB-OC共育模型，能在倒置顯微鏡下觀察2種細(xì)胞的情況，可同時(shí)收集兩室的細(xì)胞進(jìn)行定量學(xué)指標(biāo)的檢測(cè);中間隔膜的孔徑為0. 45 μm，蛋白質(zhì)可以自由通過(guò)，而OB和OC因直徑在30 μm以上，不能越過(guò)隔膜，這種細(xì)胞間液可以相互交流但細(xì)胞互不接觸的共育模型具有實(shí)際意義。

OB的增殖率能直接反映OB的生長(zhǎng)情況，是促骨形成藥物藥效評(píng)價(jià)的基本指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，梓醇干預(yù)后OB的增殖率明顯升高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，其中0. 05～2 mg/L的梓醇組作用顯著，且以0. 05 mg/L梓醇組中的A值明顯高于其它濃度組，說(shuō)明0. 05 mg/L梓醇OB增殖的能力明顯高于其它濃度組，5～100 mg/L的梓醇對(duì)OB增殖也無(wú)明顯作用，提示隨著梓醇濃度的升高，梓醇促進(jìn)OB的增殖的能力下降，推測(cè)低濃度的梓醇對(duì)OP患者OB數(shù)量下降可能具有一定的改善作用。ALP是一種普遍存在的細(xì)胞內(nèi)酶。在骨代謝異常和骨病中ALP活性可作為OB功能及分化的指標(biāo)之一。ALP在細(xì)胞中的表達(dá)多少，可反映出OB的分化程度和功能狀態(tài)，ALP活性越高，說(shuō)明前成骨細(xì)胞向成熟的OB分化得越明顯［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示梓醇組中OB的ALP活性與對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明梓醇能夠提高OB ALP的活性，促進(jìn)OB的分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Oh等［5］報(bào)道的地黃提取物能提高OB的增殖及OB中ALP的活性相一致。提示梓醇可能是地黃防治OP的有效成分之一。

骨吸收陷窩是OC骨吸收的直接結(jié)果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反映了OC的骨吸收能力［10］。因此觀察骨吸收陷窩的形態(tài)和測(cè)量陷窩的數(shù)量、大小是檢測(cè)OC骨吸收功能的可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OB-OC共育體系中不同濃度的梓醇對(duì)OC骨吸收陷窩形成數(shù)目明顯低于對(duì)照組。說(shuō)明梓醇對(duì)OC活性有直接的抑制作用。TRAP是OC釋放入循環(huán)系統(tǒng)，直接參與OC骨吸收過(guò)程中的一種溶酶體，其可以降解骨內(nèi)固體鈣磷礦化物，TRAP的出現(xiàn)標(biāo)志著OC的形成和OC活動(dòng)的開(kāi)始，并在一定程度上反映了骨吸收狀況［11-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在OB-OC共育體系中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，梓醇組和對(duì)照組TRAP活性都有所降低，提示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，OC分泌TRAP的數(shù)量和活性在下降;但在同一時(shí)段，梓醇組TRAP活性都明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明梓醇具有抑制OC分泌TRAP的能力。

梓醇是一種環(huán)烯萜類(lèi)物，是從地黃中提取出來(lái)的主要有效成分之一。曲有樂(lè)等［13］采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，熟地黃能顯著對(duì)抗老年進(jìn)程中OB孕激素受體的下降，從而對(duì)抗OP的發(fā)生，說(shuō)明地黃中的某種成分具有類(lèi)雌激素的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RTPCR的方法發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的OB在功能表達(dá)過(guò)程中均能檢測(cè)到ERα mRNA和ERβ mRNA的RT-PCR的產(chǎn)物，且ERβ mRNA的表達(dá)要高于ERα mRNA，加入梓醇后，OB中ERβ mRNA的表達(dá)水平均顯著提高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ERα mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異，提示梓醇能夠上調(diào)ERβ mRNA的表達(dá)，其原因可能與ERβ mRNA在OB中的表達(dá)高于ERα mRNA有關(guān)，這與雌激素對(duì)骨形成的作用主要是由ERβ調(diào)控的觀點(diǎn)相一致［14］。本實(shí)驗(yàn)提示梓醇可能具有類(lèi)雌激素樣作用，對(duì)此，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，我們認(rèn)為梓醇在OB-OC共育體系中能夠刺激OB的增殖、提高OB ALP活性，并同時(shí)抑制OC活性，上調(diào)OB ERβ mRNA的表達(dá)水平。梓醇可能是地黃防治OP的有效成分之一。

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Effect of catalpol on activity of osteoblasts/osteoclasts and osteoblast ERα/β mRNA expression in osteoblast-osteoclast co-culture system

LAI Man-xiang1，2，YANG Li2，ZHANG Rong-hua2
(1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China;2Pharmacy College of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of catalpol on the activity of osteoblasts ( OB) and osteoclasts ( OC)，and OB estrogen receptor ( ER)α/β mRNA expression in the OB-OC co-culture system.METHODS: OB and OC were isolated from the SD rats of 1 and 5 days old.In the OB-OC co-culture system，different concentrations of catalpol including low dosage ( 0. 05，0. 1，0. 5 and 1 mg/L)，middle dosage ( 2，5 and 10 mg/L)，and high dosage ( 20，50 and 100 mg/L) were added into the culture medium to detect the changes of OB proliferation by MTT assay.The catalpol at maximal dosage was added to OB section to detect the alkaline phosphatase ( ALP) activity of OB by pNPP method.The mRNA expression of ERα/β in the OB treated with catalpol in the co-culture system was detected by RT-PCR.The catalpol at maximal dosage was added to OC group to detect the activity of OC by microscopy and tartrate-resistantacid phosphatase ( TRAP) activity detection.RESULTS: In 0. 05～2 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was significantly increased as compared with control group in the co-culture system，and it reached the maximum value when catalpol was at 0. 05 mg/L，while in 5～100 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was not increased.The ALP activity of OB in 0. 05 mg/L catalpol group was higher than that in control group.The catalpal at 0. 05 mg/L promoted the mRNA expression of ERβ in OB in the co-culture system，but did not increase the mRNA expression of ERα as compared with control group.Catalpol at 0. 05 mg/L obviously inhibited the bone resorption and the TRAP activity in OC.CONCLUSION: Catalpol stimulates the proliferation and activity of OB，inhibits the bone resorption and activity of OC，and increases the mRNA expression of ERβ in OB in the OB-OC co-culture system，suggesting that high mRNA expression of ERβ may be the regulatory pathway of catalpol in response to bone metabolism.

［KEY WORDS］Catalpols; Osteoblasts; Osteoclasts; Estrogen receptors

通訊作者△Tel: 020-85220023; E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.81473509; No.81173619)

［收稿日期］2015-01-07［修回日期］2015-03-27

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1242-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.016