易飛舟，趙 螢，趙寅華，張 旻

(1.解放軍第105醫(yī)院，安徽 合肥 230001;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院急診與綜合臨床科，陜西 西安 710032)

關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)是臨床醫(yī)學(xué)中的難點(diǎn)，首先軟骨組織缺乏血液供應(yīng)及神經(jīng)調(diào)控，且細(xì)胞代謝緩慢，損傷后很難自行修復(fù);其次，修復(fù)后的軟骨組織結(jié)構(gòu)和功能與正常軟骨組織存在差異，極易發(fā)生退化，最終影響關(guān)節(jié)的正常功能。目前采用組織工程軟骨成為了修復(fù)軟骨缺損的新希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是從骨髓中分離出的纖維樣非造血成體干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等潛能［1］;加之其易于分離、無(wú)免疫原性及可塑性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已成為軟骨組織工程的理想種子細(xì)胞［2］。而軟骨組織為機(jī)體的承重組織，需要具備一定的機(jī)械性能以承受外界力學(xué)作用。因此，近年來(lái)關(guān)于力學(xué)刺激對(duì)組織工程細(xì)胞的影響引起了廣泛的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的力學(xué)刺激下，BMSCs可表現(xiàn)為成脂、成骨及成軟骨等多向分化的潛能，但其機(jī)理尚不明確［3-4］。

Rac1為Rho家族小G蛋白的成員，其主要功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架裝配、細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞的增殖與凋亡［5］。Rac1在力學(xué)刺激下細(xì)胞形成板狀偽足的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞骨架的裝配有重要的調(diào)節(jié)作用［6-8］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激活Rac1的活性時(shí)，不僅能使BMSCs中鈣粘蛋白的表達(dá)升高，同時(shí)還會(huì)提高SOX9、Aggrecan和Col-ⅡmRNA的轉(zhuǎn)錄水平;從而促進(jìn)細(xì)胞的軟骨向分化［9］。以上研究結(jié)果均表明，Rac1可參與介導(dǎo)力學(xué)信號(hào)的傳遞，并同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及骨架裝配，進(jìn)而調(diào)控BMSCs向成軟骨方向分化。因此，根據(jù)前期研究結(jié)果推測(cè)，Rac1可能參與調(diào)控流體靜壓力誘導(dǎo)的BMSCs增殖、骨架裝配及軟骨向分化的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用流體靜壓力作用于體外培養(yǎng)的BMSCs，同時(shí)給予Rac1激動(dòng)劑PDGF和拮抗劑NSC23766作用細(xì)胞，觀察流體靜壓力對(duì)BMSCs周期、骨架及成軟骨分化的影響，并探討Rac1在其中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);PDGF(PeproTech，美國(guó));NSC23766(Santa Cruz，美國(guó));FITC-鬼筆環(huán)肽(Sigma，美國(guó));α-MEM培養(yǎng)基、2.5 g/L 胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、100 U/mL 鏈霉素(Hyclone，美國(guó));胎牛血清(杭州四季青公司);成軟骨誘導(dǎo)液(Cyagen Biosciences，美國(guó));流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó));激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó));Real-time PCR檢測(cè)儀(BIO-RAD，美國(guó));可控細(xì)胞靜態(tài)液壓加載裝置(本課題組自制)。

1.2 大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)

采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs。取3～4周齡SD大鼠，脫頸椎處死后解剖出股骨，并沖洗出骨髓。所取骨髓經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，1 000 r/min離心5 min;然后將細(xì)胞重懸于α-MEM培養(yǎng)基(含100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青、鏈霉素)中，37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。3～4 d換液，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，胰酶消化，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 大鼠BMSCs表面標(biāo)志物鑒定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs，制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液后，取100 μL細(xì)胞懸液分別加入 FITC 標(biāo)記的 CD29、CD44、CD34、CD45;37℃孵育20 min后，將細(xì)胞重懸于0.5 mL預(yù)冷PBS中，流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)和力學(xué)刺激條件

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(C)，常規(guī)條件下培養(yǎng);Rac1激動(dòng)劑組(Rac1+):20 nmol/L PDGF作用細(xì)胞 1 h，不加載;Rac1拮抗劑組(Rac1-):100 nmol/L NSC23766作用細(xì)胞1 h，不加載;壓力組(P):加載90 kPa靜壓力1 h;Rac1激動(dòng)劑+壓力組(Rac1+/P):20 nmol/L PDGF預(yù)處理1 h后，加載90 kPa靜壓力1 h;Rac1拮抗劑+壓力組(Rac1-/P):100 nmol/L NSC23766預(yù)處理1 h后，加載90 kPa靜壓力1 h。

力學(xué)刺激采用可控細(xì)胞液壓加載裝置，刺激條件為:90 kPa壓強(qiáng)下加載1 h。該壓力加載裝置的具體特性、操作及壓力加載條件的篩選見參考文獻(xiàn)［10-12］。

1.4 不同處理對(duì)BMSCs細(xì)胞周期影響的觀察

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs，按上述分組進(jìn)行處理后，胰酶消化并收集各組細(xì)胞;調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL后，置于預(yù)冷的700 mL/L乙醇、4℃下固定24 h。測(cè)定前30 min加入PI染液，振蕩混勻并避光染色后，用流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定各組細(xì)胞的周期。

1.5 不同處理對(duì)BMSCs細(xì)胞骨架影響的觀察

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs，胰酶消化后用α-MEM培養(yǎng)液重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL。將細(xì)胞懸液接種于含有蓋玻片的24孔板中制成細(xì)胞爬片后，按上述分組進(jìn)行處理。分組處理結(jié)束后，取各組細(xì)胞爬片，分別經(jīng)40 g/L多聚甲醛液固定、5 μg/mL FITC-鬼筆環(huán)肽室溫避光染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 不同處理對(duì) BMSCs成軟骨基因表達(dá)影響的觀察

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs，用α-MEM培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL后，置于無(wú)菌離心管中室溫下150 r/min離心5 min;然后按上述分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，并置于37℃、50 mL/L CO2的條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，換用成軟骨誘導(dǎo)液(含100 nmoL/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、50 mg/mL 維生素 C、acid 2-phosphate、100 mg/mL丙酮酸鈉、40 mg/mL脯氨酸的高糖DMEM培養(yǎng)基)，并同時(shí)加入ITS-plus(含 6.25 mg/mL 牛胰島素、6.25 mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 mg/mL 亞硒酸、5.33 mg/mL 亞油酸、1.25 mg/mL牛血清白蛋白)繼續(xù)靜置培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化。誘導(dǎo)期間按分組每天加載90 kPa的靜壓力1 h，并且始終保持相應(yīng)組培養(yǎng)基中的Rac1激動(dòng)劑或拮抗劑的濃度。

于誘導(dǎo)4周后取各組細(xì)胞，分別在甲苯胺藍(lán)染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。同時(shí)采用Real-time PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因表達(dá):取誘導(dǎo)培養(yǎng)4周的各組細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后，采用PrimeScript TMRT-PCR Kit試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參，采用MJ Research DNA Engine Opticon TM2熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)，分別檢測(cè) Sox-9、Aggrecan、COL-Ⅱ各基因的表達(dá)情況;并根據(jù)所檢測(cè)Ct值，以2-△△ct法計(jì)算各組各基因的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明;所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs體外培養(yǎng)及形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)3 d時(shí)可見BMSCs集落，細(xì)胞為三角形或長(zhǎng)梭形，呈輻射狀排列(圖1a);培養(yǎng)7～9 d時(shí)，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)且集落出現(xiàn)融合;培養(yǎng)10～12 d時(shí)，細(xì)胞融合達(dá)80%以上，即可進(jìn)行傳代。傳代后的BMSCs呈長(zhǎng)梭狀且形狀均一，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)，細(xì)胞排列緊密并旋渦狀(圖1b)。

2.2 大鼠BMSCs鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，P3代大鼠BMSCs中有 95.8% 表達(dá) CD29，96.4% 表達(dá) CD44，2.1%表達(dá)CD34，2.5%表達(dá)CD45(圖2)。表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞，而非造血干細(xì)胞。

2.3 各組大鼠BMSCs的細(xì)胞增殖活性比較

細(xì)胞增殖活性指標(biāo)包括DNA合成期細(xì)胞比例(S-phase fraction，SPF)及增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，計(jì)算公式為:SPF=S/(G0/1+S+G2/M)×100%;PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%。檢測(cè)結(jié)果顯示，在Rac1+、P、Rac1+/P組中 DNA合成期的 SPF、PI均顯著高于 C組(P＜0.05)，而 Rac1-組則顯著低于C組(P＜0.05)，說(shuō)明 Rac1通路的激活及壓力都可促進(jìn)細(xì)胞周期的啟動(dòng)和增殖，若Rac1通路被抑制則可阻礙該過(guò)程;與 P組相比，Rac1-/P組中的SPF、PI均顯著降低(P ＜0.05)，提示 Rac1 通路抑制可阻斷壓力引起的細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞增殖(圖3)。

圖1 BMSCs細(xì)胞形態(tài)

圖2 BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記分子檢測(cè)

圖3 BMSCs細(xì)胞增殖活性(*與C組相比P＜0.05;#兩組相比P＜0.05)

2.4 各組大鼠BMSCs的細(xì)胞骨架檢測(cè)結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡下可見，C組中F-actin呈絲狀，并主要沿細(xì)胞長(zhǎng)軸排列，貫穿整個(gè)細(xì)胞;Rac1+組中BMSCs后邊緣突起，并形成很多板狀偽足;對(duì)BMSCs加載壓力后，除Rac1-/P組外，其他各組的F-actin纖維束均緊密排列并且明顯變粗(圖4)。

采用Image-pro plus 6.0軟件對(duì)各組圖像的熒光光密度值(Mean Density)分析顯示，P、Rac1-、Rac1-/P組中平均光密度值均明顯高于C組(P ＜0.05)，而Rac1+、Rac1+/P組的平均光密度值顯著低于C組(P＜0.05)(圖5)。提示，Rac1通路抑制及流體靜壓力均可促進(jìn)BMSCs的細(xì)胞骨架裝配，而Rac1通路的激活則對(duì)細(xì)胞骨架的裝配有阻礙作用。

圖5 各組BMSCs細(xì)胞骨架的光密度值

2.5 各組大鼠BMSCs成軟骨標(biāo)志基因表達(dá)水平的比較

成軟骨誘導(dǎo)4周后，各組BMSCs均形成細(xì)胞團(tuán)塊;甲苯胺藍(lán)染色顯示，細(xì)胞團(tuán)塊可見藍(lán)色異染顆粒(圖6)。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)4周后RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Rac1+、P、Rac1+/P組中成軟骨標(biāo)志基因Sox9、Aggrecan、Col-Ⅱ的表達(dá)量均高于C組(P＜0.05);與P組相比，Rac1+/P組中各成軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)量均顯著增高(P＜0.05)，而Rac1-/P組中各成軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)量均顯著降低(P＜0.05)(圖7)。以上結(jié)果提示，Rac1參與流體靜壓力誘導(dǎo)的BMSCs成軟骨向分化的調(diào)控，且主要為正向調(diào)控。

圖6 各組BMSCs成軟骨誘導(dǎo)4周后甲苯胺藍(lán)染色觀察結(jié)果

圖7 各組各成軟骨標(biāo)志基因表達(dá)水平的比較

3 討論

力學(xué)刺激可促進(jìn)BMSCs增殖，但其機(jī)理尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的G1期啟動(dòng)主要是由細(xì)胞周期依賴激酶(CDK)與cyclinD結(jié)合以及cyclin E的激活［13-15］。因此，G1周期的啟動(dòng)主要依賴細(xì)胞內(nèi)cyclin蛋白及CDK抑制劑的濃度。另有研究發(fā)現(xiàn)，RAC通路可通過(guò)整合蛋白啟動(dòng)cyclinD mRNA 翻譯［16］及 cyclinD 前體蛋白的表達(dá)［17］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制Rac1的活性后可促使壓力引發(fā)的細(xì)胞周期啟動(dòng)發(fā)生停滯，提示壓力可能通過(guò)整合蛋白-Rac-cyclinD通路控制細(xì)胞周期的啟動(dòng)，而抑制Rac1的活性則可影響cyclinD蛋白的表達(dá)，并最終促使細(xì)胞周期發(fā)生停滯。

細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是細(xì)胞中纖維組成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞的黏著及運(yùn)動(dòng)等提供支持［18］。而細(xì)胞骨架體系是一種受各種因素調(diào)控的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)主要依賴F-actin肌動(dòng)蛋白骨架［19］。本結(jié)果顯示，激活Rac1可導(dǎo)致板狀偽足的形成［20］，說(shuō)明細(xì)胞板狀偽足的形成主要依賴Rac的活化。而抑制Rac1活性后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，且其光密度值顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明抑制Rac的活性有助于壓力作用下應(yīng)力纖維的裝配。

流體靜壓力作為模擬軟骨關(guān)節(jié)腔中受力的一種力學(xué)加載方式［21］，對(duì)BMSCs向成軟骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用［22］，并可提高 BMSCs中 Sox9、Aggrecan及ColⅡmRNA的表達(dá)量，甚至在缺乏成軟骨分化誘導(dǎo)因子(如TGF-β3)的條件下，仍可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化［23］。有研究顯示，激活Rac1可促進(jìn) N-cadherin表達(dá)，最終上調(diào) Sox5、Sox6、Sox9、collagenⅡ、Aggrecan mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平［9］。本結(jié)果顯示，流體靜壓力可促進(jìn)大鼠BMSCs中各成軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)量顯著升高;當(dāng)在壓力條件下激活Rac1時(shí)，這種可促進(jìn)作用更明顯，Rac1+/P組中各成軟骨標(biāo)志基因Sox9、Aggrecan及Col-ⅡmRNA的表達(dá)量均顯著高于P組;而在加壓條件下抑制Rac1的活性時(shí)，各成軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)量均較P組顯著降低，該結(jié)果提示，在壓力促BMSCs成軟骨分化的過(guò)程中部分依賴于Rac1的活性。

本結(jié)果提示，在流體靜壓力導(dǎo)致的細(xì)胞周期啟動(dòng)中需依賴Rac1的活性;Rac1在壓力引發(fā)的細(xì)胞骨架裝配過(guò)程中主要為負(fù)向調(diào)控作用，而在流體靜壓力誘導(dǎo)的BMSCs成軟骨分化過(guò)程中則發(fā)揮正向調(diào)控作用。

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