滕 騰，孫 鑫，張 冉，柳忠豪

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)市口腔醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264000)

糖尿病患者體液環(huán)境中長期存在的高血糖，可影響成骨細(xì)胞的分布，引起鈣磷代謝異常，增加炎癥浸潤的程度和持續(xù)時(shí)間［1-2］，是阻礙種植體周圍骨組織生成和牙槽骨缺損的愈合、加劇牙周疾患及引起種植修復(fù)失敗的主要原因［3-5］。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是黃芪中主要的功能成分之一，為均一的多糖成分，其生物安全性已在多水平得到證實(shí)［6］。黃芪多糖不僅可保護(hù)肝腎功能，同時(shí)還具有抗氧化、減低體內(nèi)毒性脂質(zhì)代謝，以及預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、糖尿病等多種功效，有著廣泛的應(yīng)用前景［7］。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度黃芪多糖(伯恩)對MC3T3-E1進(jìn)行干預(yù)，以了解其在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化、礦化活性、細(xì)胞超微骨架結(jié)構(gòu)和表達(dá)Runx-2、OPN、OCN 的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

黃芪多糖(伯恩，天津賽諾制藥有限公司);小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1 subclong14，中科院上海細(xì)胞庫提供);α-MEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國);胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);MTT(北京索萊寶公司);茜素紅(上海源葉生物科技有限公司);羅丹明-鬼筆環(huán)肽(CytosKeleton，美國);Trizol(Invitrogen，美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM RT Reagent Kit)、RT-PCR試劑盒(SYBR Prime Ex TaqTM)(Takara，日本);病理圖像分析儀(Olympus，日本);激光共聚焦顯微鏡(TCS SPE，Leica，德國);定量酶標(biāo)儀(Multiskan MS-352，芬蘭雷勃);RT-PCR儀器(Corbett，澳大利亞)。

1.2 黃芪多糖(APS)培養(yǎng)液的配制

將9 g葡萄糖與50 mL超純水混合成高糖母液后，取0.58 mL高糖母液加入50 mL正常培養(yǎng)基配置成濃度為16.5 mmol/L的高糖培養(yǎng)基;然后在每100 mL高糖培養(yǎng)中各加入500、50、5 mg注射級黃芪多糖，分別配制成含黃芪多糖濃度為5 mg/mL(高濃度黃芪多糖，High-dose APS，HDA)、0.5 mg/mL(中濃度黃芪多糖，Medium-dose APS，MDA)、0.05 mg/mL(低濃度黃芪多糖，Low-dose APS，LDA)的高糖培養(yǎng)基。

1.3 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)

將小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1 Subclone 14)接種于含100 g/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d換液，待細(xì)胞匯合達(dá)90%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 高糖環(huán)境下APS對MC3T3-E1增殖影響的觀察

取對數(shù)生長的MC3T3-E1細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96孔板 (200 μL/孔)，并將細(xì)胞隨機(jī)分為4組(1個(gè)對照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組)，每組復(fù)5孔。其中對照組加入單純高糖培養(yǎng)基(High-glucose，HG)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含黃芪多糖濃度為5 mg/mL(HDA 組)、0.5 mg/mL(MDA 組)、0.05 mg/mL(LDA組)的高糖培養(yǎng)基(200 μL/孔)，置于 50 mL/L CO2、飽和濕度的恒溫(37℃)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、5 d，每孔加入20 μL MTT繼續(xù)孵育4 h;然后棄孔內(nèi)上清，并于每孔各加入150 μL二甲基亞砜，繼續(xù)恒溫孵育30 min至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測各孔570 nm波長處的吸光度值(A值)。

1.5 高糖環(huán)境下APS對MC3T3-E1中ALP活性影響的觀察

取對數(shù)生長的MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/孔密度接種于24孔板，按1.4的方法將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，并相應(yīng)加入含不同濃度黃芪多糖的高糖培養(yǎng)基后，置于37℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、5、7 d取各組細(xì)胞(每組3孔)，PBS沖洗后每孔加入500 mL細(xì)胞裂解液(1 mg/mL Triton X-100)裂解細(xì)胞。40 min后10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀部分用ALP工作液溶解后，置于50 mL/L CO2恒溫(37℃)培育箱中繼續(xù)孵育40 min;然后用酶標(biāo)儀檢測各孔400 nm波長下的吸光度值(A值)。

1.6 高糖環(huán)境下APS對MC3T3-E1礦化能力影響的觀察

將對數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于12孔板，并制作細(xì)胞爬片。按1.4的方法將細(xì)胞爬片隨機(jī)分為4組(每組復(fù)3孔)，并相應(yīng)加入含不同濃度黃芪多糖的高糖培養(yǎng)基后，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng);12 h后分別更換成骨誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/mL 維生素 C、0.1 μmol/L地塞米松)繼續(xù)培養(yǎng)，每 3 d換液 1次。分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14、21 d各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，并經(jīng)PBS沖洗3次、40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min后，用茜素紅(pH=4.2)進(jìn)行染色。然后在體視顯微鏡下分別觀察各組鈣化結(jié)節(jié)形成情況，并通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算鈣結(jié)節(jié)的A值。

1.7 高糖環(huán)境下APS對MC3T3-E1表達(dá)Runx-2、OPN、OCN影響的觀察

將對數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于24孔板，按1.4的方法將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，并相應(yīng)加入含不同濃度黃芪多糖的高糖培養(yǎng)基后，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后3、7 d取各組細(xì)胞，并用Trizol裂解液提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)(OD260/OD280)檢測 RNA的純度(1.8～2.0)和含量后，將其分別逆轉(zhuǎn)錄合成 Runx-2、OPN、OCN的cDNA。然后以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參照，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分別檢測各組細(xì)胞中各骨活性功能基因(Runx-2、OPN、OCN)的表達(dá)，并進(jìn)行定量分析。PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件均嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒說明;所用引物由上海生工生物工程公司完成，其具體序列見表1。

表1 骨活性功能基因及其相關(guān)引物序列

1.8 高糖環(huán)境下APS對MC3T3-E1細(xì)胞骨架影響的觀察

取對數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞以4×103/孔的密度接種于6孔板，并制作細(xì)胞爬片。按1.4的方法將細(xì)胞爬片隨機(jī)4組，并相應(yīng)加入含不同濃度黃芪多糖的高培養(yǎng)基后，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)3、6、9、12 h取各組細(xì)胞(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3孔)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，用40 g/L多聚甲醛室溫下固定10 min;PBS清洗30 s，5 mg/mL Triton X-100 透膜5 min;PBS清洗30 s，室溫避光環(huán)境下滴加200 μL羅丹明-鬼筆環(huán)肽，繼續(xù)孵育30 min;PBS再次清洗30 s后，將各細(xì)胞爬片置于滴加有抗熒光猝滅液的載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較

MTT數(shù)據(jù)顯示，LDA組和MDA組細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間變化，均呈明顯的上升趨勢(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)，LDA、MDA組的細(xì)胞增殖量均大于HDA組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但LDA組與MDA組相比，細(xì)胞增殖量無顯著性差異(P＞0.05)(表 2)。

表2 各組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性比較()

表2 各組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性比較()

* 與LDA、MDA組相比P＜0.05

組別 培養(yǎng)時(shí)間1 d 3 d 5 d LDA 0.76 ±0.02 1.79 ±0.05 2.11 ±0.02 MDA 0.73 ±0.01 1.76 ±0.04 2.09 ±0.06 HDA 0.68 ±0.01* 1.40 ±0.06* 1.57 ±0.03*對照組 0.63 ±0.02* 0.74 ±0.02* 1.23 ±0.02*

2.2 各組細(xì)胞的ALP活性比較

ALP檢測結(jié)果顯示，LDA、MDA組細(xì)胞的ALP活性隨培養(yǎng)時(shí)間變化均呈明顯上升趨勢(P＜0.05)，但各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)兩組間相比差異不明顯(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)，LDA、MDA 組細(xì)胞的ALP活性均高于HDA組和對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表3)。

表3 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性比較()

表3 各組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性比較()

* 與LDA、MDA組相比P＜0.05

組別 培養(yǎng)時(shí)間1 d 3 d 5 d 7 d LDA 0.17 ±0.003 0.18 ±0.006 0.24 ±0.005 0.26 ±0.003 MDA 0.16 ±0.006 0.16 ±0.009 0.24 ±0.004 0.26 ±0.005 HDA 0.12 ±0.005*0.13 ±0.001*0.15 ±0.004*0.17 ±0.007*對照組 0.12 ±0.003*0.12 ±0.002*0.16 ±0.006*0.16 ±0.004*

2.3 各組細(xì)胞的礦化能力比較

茜素紅染色結(jié)果顯示，LDA、MDA組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間變化而呈增加趨勢(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)均以LDA組鈣結(jié)節(jié)的吸光度值最高，由高到低依次為:LDA組＞MDA組＞HDA組＞對照組;各組間兩兩相比，除HAD組和對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各組間相比均有顯著性差異(P＜0.05)(表4)。

表4 各組MC3T3-E1細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)吸光度值比較()

表4 各組MC3T3-E1細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)吸光度值比較()

不同字母組間相比P＜0.05

培養(yǎng)時(shí)間14 d 21 d LDA 50.06 ±3.38a 83.19 ±1.95組別a MDA 39.21 ±3.62b 52.16 ±2.54b HDA 24.97 ±1.72c 21.57 ±1.64c對照組 16.22 ±0.53c 18.49 ±2.94c

2.4 各組MC3T3-E1中各骨活性基因表達(dá)水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，LDA組Runx-2、OPN、OCN的表達(dá)量均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而明顯增加(P＜0.05)，其他各組各基因的表達(dá)量則變化不明顯(P＞0.05)，或呈降低趨勢;培養(yǎng)3、7 d各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，LDA組Runx-2、OPN、OCN的表達(dá)量均高于MDA、HDA組和對照組，除其OPN的表達(dá)量在培養(yǎng)3 d時(shí)與MDA組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其他各時(shí)間點(diǎn)各基因的表達(dá)量分別與MDA、HAD組和對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1)。

圖1 各組MC3T3-E1細(xì)胞中Runx-2、OPN、OCN的mRNA表達(dá)量比較

2.5 各組MC3T3-E1細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的比較

LDA組在培養(yǎng)3 h時(shí)，細(xì)胞呈多角形，肌動(dòng)蛋白纖維束排列良好;6 h時(shí)，細(xì)胞呈短梭形不規(guī)則分化，纖維結(jié)構(gòu)清晰，有足突狀伸展;9 h時(shí)，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞長梭形伸展;12 h時(shí)，細(xì)胞繼續(xù)伸展，肌纖維貫穿胞體并交織成網(wǎng)狀排列(圖2)。

MDA組在培養(yǎng)3 h時(shí)，細(xì)胞呈多角形，纖維束不規(guī)則排列;6 h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見足突狀伸展;9 h時(shí)，細(xì)胞長梭形變，纖維束規(guī)則排列，細(xì)胞出現(xiàn)伸展;12 h時(shí)，細(xì)胞生長，纖維束結(jié)構(gòu)清晰，并貫穿胞體呈平行排列(圖3)。

HDA組和對照組在培養(yǎng)3 h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)均不規(guī)則，纖維排列紊亂;6 h時(shí)，細(xì)胞分化不明顯，纖維結(jié)構(gòu)呈環(huán)形排列;9 h時(shí)，細(xì)胞短梭形分化，纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則;12 h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)伸展和多角形分化，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白纖維排列相對規(guī)則(圖4～5)。

圖2 培養(yǎng)3、6、9、12 h時(shí)LDA組ME3T3-E1細(xì)胞骨架形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，×400)

圖3 培養(yǎng)3、6、9、12 h時(shí)MDA組ME3T3-E1細(xì)胞骨架形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，×400)

圖4 培養(yǎng)3、6、9、12 h時(shí)HDA組ME3T3-E1細(xì)胞骨架形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，×400)

圖5 培養(yǎng)3、6、9、12 h時(shí)對照組ME3T3-E1細(xì)胞骨架形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，×400)

3 討論

成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化活性是影響骨愈合的關(guān)鍵［8］。鄒麗宜等［9］發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能預(yù)防肝纖維化小鼠的骨丟失，提示黃芪多糖是中藥抗骨丟失的有效成分之一。王擁軍等［10］報(bào)道，黃芪多糖對成骨細(xì)胞的活性具有雙向調(diào)節(jié)能力，低濃度時(shí)對成骨細(xì)胞的生物活性具有促進(jìn)作用，反之則起抑制作用。體外研究證實(shí)［11］，10 ～100 μg/mL 濃度范圍的黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)BMP-2的表達(dá)，上調(diào)ERK-MAPK、P38-MAPK的磷酸化水平而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。短期低濃度APS(0.005 mg/mL)能促進(jìn)誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs的代謝和蛋白質(zhì)的合成［12］，有利于細(xì)胞的增殖和成骨分化。除此之外，100 μg/mL濃度范圍的黃芪多糖還可增強(qiáng)粒-單核祖細(xì)胞的抗凋亡能力［13］。王庭祥等［6］報(bào)道，黃芪多糖可有效減輕高血糖環(huán)境下細(xì)胞代謝脂質(zhì)的毒性作用，并能降低IL-1的表達(dá)水平、抑制IL-1誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)蛋白的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖不僅可降低糖尿病大鼠血清中TNF-α的水平，同時(shí)還可降低IL-1、IL-6的表達(dá)，并進(jìn)而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶 2、9的活性［14-15］。

由此可見，黃芪多糖有治療糖尿病及增加多種類細(xì)胞活性的雙重作用，應(yīng)用潛力巨大。故本實(shí)驗(yàn)分別通過MTT、ALP、茜素紅、RT-PCR和細(xì)胞骨架等方法，觀察體外高糖環(huán)境下不同濃度黃芪多糖對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化及相關(guān)信號基因表達(dá)的影響，以期了解黃芪多糖的作用機(jī)制及其發(fā)揮作用的適宜濃度。

MTT可反映細(xì)胞的能量代謝和增殖情況，ALP水平可反映細(xì)胞的分化活性，而通過茜素紅染色測定細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的吸光度值則可了解細(xì)胞的礦化能力。MTT和ALP檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)觀察第1天時(shí)，LDA、MDA組和對照組僅有少量的差異，但第3、5天時(shí)，LDA、MDA組細(xì)胞的增殖和分化活性則顯著升高。鈣結(jié)節(jié)吸光度值結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)LDA組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)吸光度值均明顯高于其他各實(shí)驗(yàn)組。以上數(shù)據(jù)充分說明，0.05～0.5 mg/mL的黃芪多糖是促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化較好的濃度范圍，但僅有低濃度的APS(0.05 mg/mL)才能增強(qiáng)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的礦化活性。這也與部分學(xué)者對犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的研究結(jié)果具有一定程度的一致性［12］。

Runx-2、OPN、OCN的表達(dá)與骨的發(fā)生、生長及改建等過程均有著密切的關(guān)系［16］。Runx-2的表達(dá)是成骨細(xì)胞開始分化的重要標(biāo)志，也是成骨過程中最早最特異性的標(biāo)記基因;高表達(dá)的Runx-2可以激活OCN和OPN的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并進(jìn)而促進(jìn)骨成熟［17］。成骨細(xì)胞分泌的OPN在骨吸收、骨基質(zhì)的礦化和維持骨組織完整性方面，均有非常重要的作用，其介導(dǎo)的細(xì)胞粘附是連接細(xì)胞與基質(zhì)的橋梁。OPN的出現(xiàn)，是成骨細(xì)胞基質(zhì)形成和進(jìn)入礦化成熟階段的標(biāo)志［18］。在成骨細(xì)胞分泌基質(zhì)的礦化階段，機(jī)體OPN和OCN表達(dá)均顯著增加，OCN出現(xiàn)即標(biāo)志著成骨分化成熟［19］。本結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下，LDA組MC3T3-E1細(xì)胞中Runx-2、OPN和OCN的表達(dá)量均隨時(shí)間變化而顯著增加，且明顯高于MDA、HDA組和對照組。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，低濃度的APS(0.05 mg/mL)可有效逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下成骨活性基因的低表達(dá)情況，可通過提高Runx-2、OPN和OCN的表達(dá)，而促進(jìn)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化?；虮磉_(dá)的變化規(guī)律與低濃度APS組MC3T3-E1細(xì)胞在增殖、分化和礦化活性方面的變化規(guī)律相一致，進(jìn)一步證實(shí)了低濃度的APS對MC3T3-E1細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。

細(xì)胞骨架可反映APS對成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，并進(jìn)而了解低濃度的APS在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細(xì)胞活性產(chǎn)生促進(jìn)作用的機(jī)制。細(xì)胞骨架系統(tǒng)(cytoskeleton system)是由纖維蛋白質(zhì)相互搭建起的骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其可以維持細(xì)胞形態(tài)、幫助細(xì)胞游走、輔助細(xì)胞粘附、促進(jìn)細(xì)胞伸展和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸。細(xì)胞骨架系統(tǒng)主要包括微管(microtubule)、微絲(micro-filament)和中間纖維(intermediate filament)［20］。微絲是由肌動(dòng)蛋白單體鏈(G-actin)形成的右手螺旋狀的骨架纖維，其中的G-actin不僅是組成F-actin的基礎(chǔ)纖維單位，也是構(gòu)成細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的主要組分。F-actin結(jié)構(gòu)的變化對細(xì)胞粘附、伸展有直接影響，并進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖和分化。體外研究證實(shí)［21］，在成骨細(xì)胞附著的早期，F(xiàn)-actin便開始表達(dá)。成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化是形成骨整合的前提，而細(xì)胞的粘附活性則與細(xì)胞骨架有著緊密的聯(lián)系。本結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)3 h時(shí)，LDA、MDA組的細(xì)胞分化程度即出現(xiàn)少量差異，其效果均明顯優(yōu)于HDA組和對照組;6 h時(shí)，LDA組細(xì)胞呈多角形變化，細(xì)胞骨架清晰，效果顯著優(yōu)于其他各組細(xì)胞，說明細(xì)胞在分化方面的差異明顯;9 h時(shí)，LDA組的細(xì)胞出現(xiàn)伸展，細(xì)胞內(nèi)纖維相互平行，提示細(xì)胞的增殖活性及附著能力均有所增強(qiáng)，具其效果明顯優(yōu)于其他各組;12 h時(shí)，LDA組的細(xì)胞骨架交織呈網(wǎng)狀，較其他各組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)更為清晰。以上結(jié)果提示，高糖環(huán)境下 0.05 mg/mL的黃芪多糖能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)肌蛋白纖維骨架的伸展和成熟，提高細(xì)胞的粘附能力，并進(jìn)一步促進(jìn)MC3T3-E1的增殖、分化活性，促進(jìn)骨整合。

綜上所述，低濃度(0.05 mg/mL)的黃芪多糖可通過促進(jìn)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維骨架的成熟和伸展以及增加Runx-2、OPN、OCN的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對MC3T3-E1細(xì)胞的不利影響，從而增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化活性。雖然本次實(shí)驗(yàn)在黃芪多糖分子機(jī)制方面的研究仍存在一定的局限性，但可進(jìn)一步推斷，通過黃芪多糖的緩釋、控釋，可以有效提高糖尿病患者種植體的骨結(jié)合能力和牙周、牙槽骨缺損的愈合效果。其具體緩釋控釋效果和促進(jìn)骨愈合的分子機(jī)制仍待于進(jìn)一步研究與證實(shí)。

［1］Wang TF，Jen IA，Chou C，et al.Effects of Periodontal Therapy on Metabolic Control in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus and Periodontal Disease:a meta-analysis［J］.Medicine(Baltimore)，2014，93(28):e292

［2］De Morais JA，Trindade-Suedam IK，Pepato MT，et al.Effect of diabetes mellitus and insulin therapy on bone density around osseointegrated dental implants:a digital subtraction radiography study in rats［J］.Clin Oral Implant Res，2009，20(8):796-801.

［3］Anner R，Grossmann Y，Anner Y，et al.Smoking，diabetes mellitus，periodontitis，and supportive periodontal treatment as factors associated with dental implant survival:a long-term retrospective evaluation of patients followed for up to 10 years［J］.Implant Dent，2010，19(1):57-64.

［4］Freude T，Braun KF，Hang A，et al.Hyperinsulinemia reduces osteoblast activity in vitro via upregulation of TGF-β［J］.J Mol Med，2012，90(11):1257-1266.

［5］Erdogan O，Charudilaka S，Tatli U，et al.A review on alveolar bone amgmentation and dental implant success in diabetic patients［J］.Oral Surgery，2010，3(1):115-119.

［6］王庭祥，楊賀，鐘麗英，等.黃芪多糖毒性試驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36(23):4518-4519.

［7］金璽，卞蓉榮，沈山梅.黃芪多糖治療糖尿病作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19(11):2026-2028.

［8］Ma Y，Zheng Y，Huang X，et al.Mineralization behavior and interface properties of BG-PVA/bone composite implants in simulated body fluid［J］.Biomed Master，2010，5(2):1-8.

［9］鄒麗宜，吳鐵，崔燎.黃芪多糖對肝纖維化小鼠骨丟失的防治作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2002，12(2):95-98.

［10］王擁軍，宋莉君，孫愛貞.黃芪多糖的提取及對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞成骨能力的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，1999，7(6):1-4.

［11］He X，Shu J，Xu L，et al.Inhibitory effect of Astragalus polysaccharides on lipopolysaccharide-induced TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells［J］.Molecules，2012，17(3):3155-3164.

［12］許春姣，翦新春，郭峰，等.黃芪多糖對犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，25(5):432-436.

［13］Xiao B，Xu Y，He H，et al.Anti-apoptotic effect of Astragalus Polysaccharide on myeloid cells［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2013，21(5):1243-1247.

［14］Schrauwen P，Mensink M，Schaart G，et al.Reduced skeletal muscle uncoupling protein-3 content in prediabetic subjects and type 2 diabetic patient:restoration by rosiglitazone treatment［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91(4):1520-1525.

［15］Chen W，Li Y，Yu M，et al.Astragalus polysaccharides:an effective treatment for diabetes prevention in NOD mice［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2008，116(8):468-474.

［16］Coelho PG，Takayama T，Yoo D，et al.Nanometer-scale features on micrometer-scale surface texturing:a bone histological，gene expression，and nanomechanical study［J］.Bone，2014，65(18)，25-32.

［17］Kim HJ，Park JW，Lee KH，et al.Plant homeodomain finger protein 2 promotes bone formation by demethylating and activating Runx-2 for osteoblast differentiation ［ J］.Cell Res，2014，24(10):1231-1249.

［18］Viale-Bouroncle S，Gosau M，Morsczeck C，et al.Collagen 1 induces the expression of alkaline phosphatase and osteopontin via independent activations of FAK and ERK signaling pathways［J］.Arch Oral Biol，2014，59(12):1249-1255.

［19］Son JH，Cho YC，Sung IY，et al.Melatonin promotes osteoblast differentiation and mineralzation of MC3T3-E1 cells under hypoxic conditions thromgh activation of PKD/p38 pathway［J］.J Pineal Res，2014，57(4):385-392.

［20］Tsai JC，Wu CL，Chien HF，et al.Reorganization of cytoskeleton induced by 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its correlation with mitochondrial dysfunction ［J］.Lasers Surg Med，2005，36(5):398-408.

［21］Nebe B，F(xiàn)inke B，Luthen F，et al.Improved initial osteoblast functions on amino-functionalized titanium surfaces［J］.Biomol Eng，2007，24(5):447-454.