楊雪超，李曉寧，王偉東，呂孝帥

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510140;2.煙臺(tái)市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，山東 煙臺(tái) 264000)

誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化是牙本質(zhì)再生組織工程的關(guān)鍵因素。牙本質(zhì)與牙髓組織密切接觸，是成牙本質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的胞外基質(zhì)礦化產(chǎn)物，由于牙本質(zhì)組織結(jié)構(gòu)具有多孔性，以及脫礦后可以釋放生物活性分子的特點(diǎn)，使牙本質(zhì)成為一種較理想的生物支架。有研究表明，脫礦牙本質(zhì)覆蓋在牙髓表面可誘導(dǎo)其分化為骨樣牙本質(zhì)和管狀牙本質(zhì)［1］;經(jīng)過酸處理的牙本質(zhì)種植人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)移植入裸鼠背部8周后，觀察到有修復(fù)性牙本質(zhì)樣組織生成及陷窩樣細(xì)胞形成［2］;Huang等用EDTA和檸檬酸處理的牙本質(zhì)片上接種hDPSCs體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有成牙本質(zhì)細(xì)胞突起伸入到牙本質(zhì)小管內(nèi)［3］。以上研究提示，經(jīng)酸處理的牙本質(zhì)片具有成骨潛能，可作為牙本質(zhì)支架;但牙本質(zhì)片經(jīng)酸處理后常表現(xiàn)出過度脫礦而結(jié)構(gòu)疏松。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用不同根管沖洗劑處理牙本質(zhì)片，并在其上接種hDPSCs，比較hDPSCs在不同牙本質(zhì)片增殖分化的能力，以評(píng)估何種根管沖洗劑處理能為hDPSCs的粘附和增殖提供較為理想的微環(huán)境，并誘導(dǎo)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。對(duì)這種生物學(xué)治療方法的研究，將為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(FBS)、慶大霉素、α-MEM培養(yǎng)基、2.5 g/L 胰蛋白酶(Gibco，美國);PicoGreen雙鏈DNA定量試劑盒(Molecular Probes，美國);Qiagen RNA提取試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(Qiagen，美國);四甲基硅烷(Merck，德國);噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國);堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定試劑盒(南京建成);手用ProTaper銼、不銹鋼K銼(Dentsply，美國);酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國);熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國);掃描電子顯微鏡(Tescan，捷克)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

按照本課題組先前建立的實(shí)驗(yàn)方案［4］，使用本實(shí)驗(yàn)室保存的成人牙髓干細(xì)胞作為研究對(duì)象。細(xì)胞復(fù)蘇后，用含100 mL/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基在常規(guī)條件下培養(yǎng)，備用。

1.3 牙本質(zhì)片的制備

收集年齡在18～20歲因正畸而拔除的完整無齲前磨牙，浸泡于含1 000 U/mL青霉素及1 000 mg/L鏈霉素的生理鹽水中，超聲清潔震蕩3次×5 min(每次更換生理鹽水)。用金剛砂鉆或裂鉆沿釉牙骨質(zhì)界磨除牙冠，去除牙髓后，室溫下用胰酶消化1 h，去除殘存牙周膜及牙髓組織。將牙根浸泡于生理鹽水中，超聲清潔震蕩3次×5 min(每次更換生理鹽水)。

將所有牙根隨機(jī)分成A、B、C組，按逐步深入法進(jìn)行根管預(yù)備:依次使用#10、#15 K銼、手用ProTaper(SX、S1、F1、F2、F3)擴(kuò)大根管。每次更換器械時(shí)，A組用52.5 g/L NaClO沖洗(陰性對(duì)照組);B組用30 mL/L過氧化氫液和52.5 g/L Na-ClO交替沖洗;C組用170 g/L EDTA和52.5 g/L NaClO交替沖洗。3組預(yù)處理結(jié)束后，超聲沖洗3次×1 min，PBS沖洗。所有操作均由同一位醫(yī)生獨(dú)立完成。選擇X線片示預(yù)備達(dá)到根管工作長度的牙齒作為實(shí)驗(yàn)樣品。培養(yǎng)的hDPSCs生長于培養(yǎng)板，作為空白對(duì)照組(D組)。

用高速裂鉆將A、B、C組牙根沿根管長軸縱向磨開，制成縱斷牙本質(zhì)片，暴露根管縱斷面，超聲沖洗3次×1 min后，轉(zhuǎn)移到EP管中，用含1 000 U/mL青霉素及1 000 mg/L鏈霉素的PBS浸泡，4℃低溫貯存待用。

1.4 hDPSCs與牙本質(zhì)片復(fù)合培養(yǎng)

取第 5代 hDPSCs，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化5 min，用含血清培養(yǎng)基終止消化，制成2×105/樣本的單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分別接種于3組牙本質(zhì)片的根管內(nèi)壁上;D組細(xì)胞直接種于培養(yǎng)液。然后置于含100 mL/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，在37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次。

1.5 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

體外培養(yǎng) hDPSCs第 2、4、7、14天時(shí)，各時(shí)間段分別經(jīng)PBS洗滌后，每孔加MTT液(5 mg/mL，用PBS配制，pH為7.4)500 μL繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，然后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加200 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長處的吸光度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 ALP活性的檢測(cè)

體外培養(yǎng) hDPSCs第4、7、14天時(shí)，冷 PBS洗滌培養(yǎng)復(fù)合物3遍，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液，室溫振蕩10 min，并收集上清液。按照試劑盒說明檢測(cè)標(biāo)本的ALP活性，酶活性單位為樣品中每克蛋白在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。

1.7 RT-PCR檢測(cè)各礦化基因的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein，DSPP)及牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 -1(dentin matrix protein-1，DMP-1)的表達(dá)水平，以評(píng)估hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化的能力。使用Qiagen RNA提取試劑盒提取總RNA，用1 g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參。人特異性引物根據(jù)GenBank中已發(fā)布的基因序列設(shè)計(jì)見表1。25 μL反應(yīng)條件為:95℃、3 min預(yù)變性;40個(gè)反應(yīng)循環(huán)設(shè)定為95℃、15 s變性，60℃、30 s退火;延伸溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為60 s(反應(yīng)在熒光定量PCR儀中進(jìn)行)。反應(yīng)結(jié)束后，各樣本獲得相應(yīng)的Ct值，表示達(dá)到一個(gè)固定的熒光強(qiáng)度需要的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)，Ct值與樣本待檢測(cè)的基因表達(dá)水平成反比關(guān)系?；虻臄U(kuò)增效率通過GAPDH內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(ΔCt=Ct基因-CtGAPDH);不同樣本之間基因表達(dá)水平差異通過 ΔΔCt(ΔCt基因-ΔCt對(duì)照)來評(píng)估，每個(gè)檢測(cè)均重復(fù)3次。

表1 Real-Time PCR引物序列

1.8 SEM 觀察

培養(yǎng)第7、14天時(shí)，培養(yǎng)復(fù)合物用 PBS漂洗3次，20 mL/L戊二醛液固定5 min，梯度乙醇脫水至1 000 mL/L，滴加四甲基硅烷于室溫?zé)o塵環(huán)境下干燥，常規(guī)噴金后SEM觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較用one way-ANOVA(post-hoc Tukey檢驗(yàn))，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同根管沖洗劑對(duì)hDPSCs增殖能力的影響

hDPSCs凍存復(fù)蘇后，皆以單細(xì)胞方式貼壁生長，細(xì)胞呈梭形、纖維樣。傳代后細(xì)胞呈放射狀集落生長，形態(tài)穩(wěn)定，生長旺盛(圖1)。實(shí)驗(yàn)組第2～7天，3組細(xì)胞都處于不同程度的增殖狀態(tài);第7～12天，3組細(xì)胞則表現(xiàn)為增殖停滯，且數(shù)量有減少的趨勢(shì)。組間比較發(fā)現(xiàn)，C組細(xì)胞增殖速度最快，表明其細(xì)胞活力狀態(tài)最好，增殖能力最強(qiáng)(P＜0.05)(圖2)。

圖1 倒置光學(xué)顯微鏡下第5代hDPSCs(×20)

圖2 不同根管沖洗劑處理后3組牙本質(zhì)片上hDPSCs的生長曲線

2.2 SEM 觀察結(jié)果

機(jī)械預(yù)備結(jié)合3種不同沖洗方法處理的根管內(nèi)壁存在明顯差異:A組牙本質(zhì)小管未完全打開，大量玷污層未去除;B組牙本質(zhì)小管打開，玷污層基本去除;C組可明顯看出牙本質(zhì)小管成漏斗狀敞開，玷污層完全去除(圖3)。hDPSCs分別接種于牙本質(zhì)片復(fù)合培養(yǎng)后第7天，A、B、C組細(xì)胞均伸展充分、粘附良好，交疊生長呈網(wǎng)狀覆蓋根管內(nèi)壁(圖4)。第14天，C組細(xì)胞增殖較快，數(shù)量明顯多于A、B組，且細(xì)胞呈梭形、形狀規(guī)則、排列整齊、胞體緊貼根管內(nèi)壁(圖5)。

圖4 hDPSCs分別接種于3組牙本質(zhì)片復(fù)合培養(yǎng)第7天(SEM，×1 000)

圖5 hDPSCs分別接種于3組牙本質(zhì)片復(fù)合培養(yǎng)第14天(SEM，×1 000)

2.3 不同根管沖洗劑對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響

A、B、C組hDPSCs的ALP活性在培養(yǎng)期間均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。培養(yǎng)第14天時(shí)，各組ALP活性均高于其他各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。組間比較顯示，培養(yǎng)第4天時(shí)，3組細(xì)胞的ALP活性無顯著性差異;但從第7天開始，C組細(xì)胞的ALP活性顯著高于A、B、D組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與D組相比，3個(gè)處理組細(xì)胞的ALP活性在培養(yǎng)期間均顯著升高(P＜0.05)(圖6)。

圖6 各組細(xì)胞的ALP活性

2.4 不同根管沖洗劑對(duì)hDPSCs各礦化基因表達(dá)的影響

以D組細(xì)胞第4天的mRNA表達(dá)水平為基線值(相對(duì)的表達(dá)水平為100%)，A、B、C組礦化基因OC、DSPP、DMP-1 mRNA的表達(dá)水平顯示出相似的變化趨勢(shì):第7天時(shí)，A、B、C組基因表達(dá)水平顯著高于D組(P＜0.05);第14天時(shí)，C組各基因表達(dá)水平顯著高于A、B、D組(P＜0.05)(圖7)。

圖7 各組hDPSCs各礦化相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化是牙本質(zhì)再生組織工程的關(guān)鍵因素。而與牙髓干細(xì)胞分化方向有關(guān)的主要因素之一是細(xì)胞生長所處的環(huán)境。牙本質(zhì)與牙髓組織密切接觸，是一種富含細(xì)胞外基質(zhì)(約90%膠原蛋白，主要為Ⅰ型膠原蛋白)的無細(xì)胞礦化組織。牙本質(zhì)非膠原蛋白(Dentin non-collagenous proteins，DNCP)主要由牙本質(zhì)特異性蛋白、非特異性蛋白、生長因子、蛋白多糖及少量脂質(zhì)等組成;牙本質(zhì)特異性蛋白包括牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)、牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)及牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 -1(DMP-1)等［5］。有研究表明，DNCP對(duì)于骨骼、牙齒等硬組織的形成，重要細(xì)胞表型分化及生物力學(xué)性能都有重要的調(diào)控作用，高濃度的DNCP可顯著上調(diào)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP活性和礦化能力［6］。同時(shí)牙本質(zhì)小管的多孔結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞的粘附、增殖與分化提供結(jié)構(gòu)和機(jī)械支持。Smith等發(fā)現(xiàn)齲損可導(dǎo)致牙本質(zhì)脫礦，并能促進(jìn)與牙本質(zhì)再生有關(guān)生物因子的釋放［7］。郭維華等［8］將大鼠牙囊干細(xì)胞接種于EDTA處理過的健康牙本質(zhì)片上，能夠分化成牙本質(zhì)細(xì)胞，植入裸鼠體內(nèi)后，可再生并形成牙本質(zhì)。Huang等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過弱酸處理的牙本質(zhì)片，能夠支持干細(xì)胞的增殖與分化［3］。本實(shí)驗(yàn)選擇牙本質(zhì)片作為細(xì)胞粘附生長材料，并用不同根管沖洗液沖洗根管壁，使根管壁內(nèi)形成不同的微環(huán)境，研究不同環(huán)境下的牙本質(zhì)對(duì)hDPSCs增殖與分化的影響。

臨床上常用的根管沖洗液包括52.5 g/L Na-ClO、170 g/L EDTA、30 mL/L過氧化氫等。NaClO具有較強(qiáng)的組織溶解與抑菌消毒作用，但對(duì)玷污層中的無機(jī)成分無效。NaClO的濃度越高，其組織溶解能力及抗菌性越強(qiáng)，但高濃度的NaClO能刺激或影響正常組織。過氧化氫具有發(fā)泡作用，有利于根管內(nèi)雜質(zhì)和牙本質(zhì)碎屑沖出根管。EDTA是一種螯合劑，能與羥基磷灰石中的鈣離子形成可溶性絡(luò)合物，使牙本質(zhì)軟化，有效去除根管壁玷污層中的無機(jī)成分，但對(duì)玷污層中的有機(jī)成分無效且抗菌性能弱。EDTA和NaClO聯(lián)合應(yīng)用不僅可以有效去除玷污層中的無機(jī)和有機(jī)成分，還具有開放牙本質(zhì)小管的功能，為NaClO向牙本質(zhì)小管和側(cè)副根管的深入殺菌作用奠定基礎(chǔ)［9］。Dogan等發(fā)現(xiàn)，EDTA和NaClO的聯(lián)合使用可改變根管牙本質(zhì)的礦物質(zhì)含量，而單獨(dú)使用EDTA時(shí)則不能顯著改變礦物質(zhì)的含量［10］，提示EDTA和牙本質(zhì)的有機(jī)物均在脫礦作用中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)采用不同根管沖洗劑預(yù)備根管，用處理后的根管內(nèi)壁牙本質(zhì)作為支架，在體外與hDPSCs進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。SEM結(jié)果顯示A、B、C組上均有牙髓干細(xì)胞粘附生長，且C組細(xì)胞數(shù)目最多，呈梭形，形態(tài)似成牙本質(zhì)細(xì)胞，排列較規(guī)則。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)時(shí)間下，C組細(xì)胞數(shù)量高于A、B組，也證明了EDTA和NaClO交替沖洗產(chǎn)生的細(xì)胞毒性最弱。Ring等［11］通過比較幾種根管沖洗劑對(duì)DPSCs粘附生長的影響，結(jié)果也表明EDTA與NaClO組細(xì)胞毒性要弱于單獨(dú)使用NaClO組。

微環(huán)境中存在的生物活性分子對(duì)干細(xì)胞的分化起重要作用。牙本質(zhì)被稱為“化石”分子的儲(chǔ)存庫，這些分子具有生物活性，并且他們的釋放影響牙髓的反應(yīng)［12］。通過充分的機(jī)械預(yù)備、化學(xué)處理，牙本質(zhì)小管完全打開，暴露出大量活性分子位點(diǎn)，釋放出可溶性的生物活性分子，形成利于細(xì)胞增殖分化的局部誘導(dǎo)微環(huán)境。通過檢測(cè)ALP活性及分化相關(guān)特異性基因的表達(dá)水平，EDTA與NaClO交替沖洗處理的牙本質(zhì)更能促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)中3組不同的處理方式，為牙髓干細(xì)胞提供不同的誘導(dǎo)微環(huán)境。EDTA能較徹底去除牙本質(zhì)表面玷污層，充分暴露牙本質(zhì)小管及膠原纖維，并改善牙本質(zhì)的滲透性，釋放活性因子誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過EDTA和NaClO交替沖洗后的牙本質(zhì)壁為牙髓干細(xì)胞的粘附和增殖提供了較為理解的微環(huán)境，并能誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化，為組織工程牙髓再生提供了新思路。此實(shí)驗(yàn)方法與臨床緊密聯(lián)系，更適合于臨床應(yīng)用，為一種有效、實(shí)用的組織再生牙本質(zhì)支架處理方法。

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