馬峻 陳高瞻 董潔莉 袁紅梅 蘆蓮 朱才會 余曉麗

?

·短篇論著·

武漢地區(qū)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌臨床分離株katG基因突變的分子特征分析

馬峻 陳高瞻 董潔莉 袁紅梅 蘆蓮 朱才會 余曉麗

結(jié)核病是由Mtb感染所致的慢性傳染性疾病。近年來，隨著MDR和XDR的不斷產(chǎn)生，結(jié)核病以更嚴峻的形式威脅著人類的健康。異煙肼(isoniazid，INH)是一個不可或缺的抗結(jié)核一線藥物。文獻報道，異煙肼耐藥主要與katG基因突變密切相關[1]。同時不同分型技術的研究結(jié)果顯示全世界結(jié)核病的流行主要是由幾種特殊的Mtb家族所引起[2]，并且不同的基因家族具有獨特的分子特征、地區(qū)性分布和致病性，其中北京基因型菌株具有更強的毒力、傳播力，且與耐藥性有關。因此，Mtb北京基因型菌株可能與耐藥表型存在一定的聯(lián)系，但不同區(qū)域的研究結(jié)果又有所不同。

筆者旨在探討武漢地區(qū)Mtb臨床分離株耐異煙肼katG基因突變特點，為進一步研究Mtb耐藥機制及耐藥結(jié)核病的快速檢測提供依據(jù)；通過對武漢地區(qū)Mtb臨床分離菌株的基因分型，初步分析北京基因型菌株在武漢地區(qū)的流行趨勢，并探討耐異煙肼katG315基因突變與北京基因型之間的相關性。

材料和方法

一、菌株來源

臨床Mtb菌株于2012年6月至2013年6月分離自武漢市醫(yī)療救治中心3995例結(jié)核病患者痰標本，該組標本總陽性率32.0% (1278/3995)，其中耐藥菌株474株(37.1%，474/1278)。利用Excel軟件中的RAND函數(shù)從474株耐藥菌株中采用數(shù)字表法隨機抽取64株；從804株敏感菌株中采用數(shù)字表法隨機抽取21株，共計85株。分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定、絕對濃度法藥物敏感性試驗均按《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]進行。H37Rv標準菌株 (ATCC27294)購自中國藥品生物制品鑒定所。

二、方法

1. DNA制備：菌株接種在改良的羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3周至對數(shù)生長期，取出少量菌株，加入適量TE緩沖液，80 ℃滅活40 min。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取分離菌株的DNA，Thermo NanoDrop 2000微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn))測定DNA的濃度和純度，并將濃度稀釋至10 ng/μl，放置于-20 ℃保存待檢。

2. PCR擴增：katG擴增引物用Primer Premier 5.0軟件設計，上游引物序列P1：5′-TCGGCGATGAGCGTTACAG-3′(katG-F)；下游引物序列P2： 5′-CGTCCTTGGCGGTGTATTG-3′(katG-R)，產(chǎn)物長度為459 bp，包含katG315位點。PCR體系(50 μl)：10×PCR Buffer(5 μl)，10 mmol/L dNTP mix(4 μl)，10 μmol/L上游引(1 μl)，10 μmol/L下游引(1 μl)，2.5 U/μl Taq酶(0.3 μl)，10 ng/μl DNA(1 μl)；PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，68 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

3.DNA序列分析：將katG的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，送生工生物工程股份有限公司進行測序。使用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的局部序列比對基本檢索工具(basic local alignment search tool， BLAST)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，將測序結(jié)果與Mtb標準株H37Rv相應基因進行序列比對，判斷突變基因突變位點及形式。

4.分子分型：參考文獻[4]的方法，基于缺失基因片段的多重PCR(DTM-PCR)方法鑒定北京基因型菌株。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR反應擴增得到761 bp片段為北京基因型，擴增得到1466 bp片段則為非北京基因型。

5.統(tǒng)計學分析：實驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，通過卡方檢驗對katG315基因突變與北京基因型相關性分析，P<0.05代表有顯著相關性。

結(jié) 果

一、藥敏結(jié)果

根據(jù)絕對濃度法藥敏結(jié)果顯示：85株Mtb臨床分離株中，對異煙肼耐藥者有64株，其中有5株為低耐藥，59株高耐藥；其余21株對異煙肼敏感。

二、katG核酸序列的突變結(jié)果

64株對異煙肼耐藥的菌株中，65.6%(42/64)katG檢測到突變。katG315位點突變最為普遍，突變率達到60.9%(39/64)；其中S315T(AGC→ACC)是katG315最常見的突變類型，katG315位點還檢測到了其他3種突變類型：S315T(AGC→ACA)、S315A(AGC→AAC)、S315G(AGC→GGC)。katG基因內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了3種新的突變位點：G273S、I266T和P232S。測序結(jié)果見表1。21株異煙肼敏感菌株中katG未檢測到突變。

表1 耐異煙肼的64株Mtb分離株katG基因突變結(jié)果

注 WT：野生型；RH：異煙肼高濃度耐藥(10 μg/ml)；RL：異煙肼低濃度耐藥(1 μg/ml)

三、RD105基因缺失法分型結(jié)果

85株Mtb菌株中有75株(88.2%)為北京基因型；10株(11.8%)為非北京基因型。耐異煙肼的菌株中北京基因型菌株占92.2%(59/64)。部分北京基因型和非北京基因型菌株擴增產(chǎn)物電泳條帶見圖1。

M：DNA Marker；R：標準株H37Rv；1～7：臨床分離株編號；0：空白對照圖1 RD105缺失基因檢測PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

四、統(tǒng)計學分析結(jié)果

北京基因型、非北京基因型與katG315基因突變的相關性分析結(jié)果，顯示兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.54，P>0.05)，即沒有顯著相關性。

討 論

異煙肼作為不可或缺的一線抗結(jié)核藥物，其耐藥機制也是所有抗菌藥物中最為復雜的一個，至今尚未完全闡明清楚[5]。有研究報道其常見的突變位點為第315位密碼子[6-7]。本研究中INH耐藥分離株中katG突變率為65.6%(42/64)，其主要的突變位點315突變率為60.9%(39/64)，這與浙江地區(qū)(69.3%)和美國加利福利亞地區(qū)(68.7%)315突變位點突變率相當，但低于巴西(78.5%)和印度(82.95%)等國家的報道[8-11]。這表明katG315突變存在一定的地理差異。

本研究同時發(fā)現(xiàn)katG基因的3種新的突變位點：G273S(GGT→AGT)、I266T(ATC→ACC)和P232S(CCG→TGG)，其中發(fā)生G273S和I266T點突變的菌株表型為異煙肼高耐藥，但突變位點是否與異煙肼高耐藥有關仍待進一步驗證。耐異煙肼Mtb突變位點的研究將為進一步探討耐藥機制及耐藥結(jié)核病的快速檢測提供依據(jù)。

北京基因型菌株流行廣泛，但在世界不同區(qū)域北京基因型菌株的比例差異較大。在中國不同地區(qū)北京基因型也有明顯的地域性差異，如北京市92.6%[12]，寧夏78.3%[13]，內(nèi)蒙古85.5%[14]，吉林89.8%[12]，陜西80.0%[12]，新疆65.3%[12]，福建54.5%[12]，廣西55.3%[15]。本研究利用RD105基因缺失檢測法鑒定出分離株中北京基因型的比率為88.2%，北京基因型菌株為武漢地區(qū)Mtb的優(yōu)勢菌株。同時，Zhao等[16]報道福建、貴州、遼寧、上海、西藏5個省(直轄市、自治區(qū))katG315與北京基因型沒有顯著相關性，和本研究結(jié)果一致。

綜上，武漢地區(qū)流行的異煙肼耐藥菌株中katG突變率為65.6%(42/64)；本研究發(fā)現(xiàn)了3個新的突變位點，是否與異煙肼耐藥有關需要進一步研究；katG主要突變位點315的突變率為60.9%(39/64)，存在一定的地理差異，與北京基因型無顯著相關性。

[1] Hoshide M, Qian L, Rodrigues C, et al. Geographical dif-ferences associated with single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in nine gene targets among resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 2014, 52(5): 1322-1329.

[2] Hanekom M, Streicher EM, Van de Berg D, et al. Population structure of mixed Mycobacterium tuberculosis infection is strain genotype and culture medium dependent. PLoS One, 2013, 8(7): e70178.

[3] 中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程. 北京: 中國教育文化出版社，2006.

[4] Chen J, Tsolaki AG, Shen X, et al. Deletion-targeted multiplex PCR (DTM-PCR) for identification of Beijing/W genotypes of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis(Edinb), 2007, 87(5): 446-449.

[5] Almeida Da Silva PE, Palomino JC. Molecular basis and me-chanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: classical and new drugs. J Antimicrob Chemother, 2011, 66(7): 1417-1430.

[6] Zakerbostanabad S, Titov LP, Bahrmand AR. Frequency and molecular characterization of isoniazid resistance in katG region of MDR isolates from tuberculosis patients in southern endemic border of Iran. Infect Genet Evol，2008, 8(1): 15-19.

[7] Escalante P, McKean-Cowdin R, Ramaswamy SV, et al. Can mycobacterial katG genetic changes in isoniazid-resistant tuberculosis influence human disease features? Int J Tuberc Lung Dis, 2013, 17(5): 644-651.

[8] 戎奇吉, 呂火祥, 孫愛華. 基因芯片快速檢測結(jié)核分枝桿菌katG基因突變及其與異煙肼耐藥相關性. 中國人獸共患病學報, 2011, 27(3): 233-237.

[9] Perizzolo PF, Dalla Costa ER, Ribeiro AW, et al. Charac-teristics of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in southern Brazil. Tuberculosis(Edinb), 2012, 92(1): 56-59.

[10] Metcalfe JZ, Kim EY, Lin SY, et al. Determinants of multidrug-resistant tuberculosis clusters, California, USA, 2004—2007. Emerg Infect Dis, 2010, 16(9): 1403-1409.

[11] Gupta A, Prakash P, Singh SK, et al. Rapid genotypic detection of rpoB and katG gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Northern India as determined by MAS-PCR. J Clin Lab Anal, 2013, 27(1): 31-37.

[12] 趙秀芹, 董海燕, 劉志廣, 等. 中國部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株分布初步分析. 實用預防醫(yī)學, 2012, 19(5): 662-664.

[13] 王曉平, 逄宇, 趙曉, 等. 寧夏回族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關系的研究. 中國防癆雜志, 2013, 35(9): 655-659.

[14] 余琴, 蘇云開, 呂冰, 等. 內(nèi)蒙古自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌 Spoli-gotyping 分型及北京家族分析. 中國防癆雜志, 2013, 35(4):276-281.

[15] Dong H, Liu Z, Lv B, et al. Spoligotypes of Mycobacterium tuberculosis from different provinces of China. J Clin Microbiol, 2010, 48(11): 4102-4106.

[16] Zhao LL, Chen Y, Liu HC, et al. Molecular characterization of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(4): 1997-2005.

(本文編輯：薛愛華)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.018

武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學科研項目(WX12C09)

430023 武漢市醫(yī)療救治中心檢驗科(馬峻、董潔莉)，病理科(袁紅梅)；武漢輕工大學生物與制藥工程學院(陳高瞻、蘆蓮、朱才會、余曉麗)

2014-07-22)