何建 譚芳

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·短篇論著·

基因芯片檢測(cè)技術(shù)快速診斷耐藥肺結(jié)核的效果分析

何建 譚芳

通過(guò)耐藥檢測(cè)了解結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況，并以此為依據(jù)指導(dǎo)抗結(jié)核化療方案的制定，對(duì)于耐藥結(jié)核病的臨床治療具有重要的意義。傳統(tǒng)耐藥結(jié)核病的診斷是根據(jù)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)來(lái)判斷，但檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。目前對(duì)此類肺結(jié)核的早期、快速診斷是研究熱點(diǎn)，且有一些新技術(shù)出現(xiàn)。我院自2013年7月份采用基因芯片檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH和RFP是否耐藥的快速檢測(cè)，同時(shí)與傳統(tǒng)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，以分析該項(xiàng)技術(shù)對(duì)耐藥結(jié)核病的診斷效果。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

搜集2013年7月1日至2014年11月30日宜昌市所有登記為痰涂片陽(yáng)性和痰結(jié)核培養(yǎng)陽(yáng)性的肺結(jié)核患者共296例。各縣(區(qū))由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員將涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本或涂陰患者的痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，用痰標(biāo)本和菌株運(yùn)輸箱運(yùn)送至宜昌市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室。宜昌市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本或菌株后，于24 h內(nèi)采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。同時(shí)對(duì)痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，送檢的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌株經(jīng)菌種鑒定后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

二、 標(biāo)本納入情況

在此期間共收到來(lái)自于296例患者的痰菌陽(yáng)性標(biāo)本共296份，其中痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本233份，培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本63份。 233份痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)成功219份，培養(yǎng)陰性14份；培養(yǎng)陽(yáng)性的63份標(biāo)本有2份進(jìn)行菌種鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌而未予納入。因此,共有痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本219份及培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本61份共280份痰菌陽(yáng)性標(biāo)本入選。

三、檢測(cè)方法

(一)痰涂片找抗酸桿菌

采用萋?tīng)?尼爾遜染色法，嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并考核合格的專職人員完成。

(二)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

對(duì)痰標(biāo)本采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性菌株采用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群初步鑒定，PNB培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)即為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；PNB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)即為非結(jié)核分枝桿菌。 對(duì)結(jié)核分枝桿菌采用絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)方法嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]。低濃度含藥培養(yǎng)基未生長(zhǎng)分枝桿菌報(bào)告敏感，生長(zhǎng)者報(bào)告耐藥。

(三)基因芯片耐多藥檢測(cè)技術(shù)

采用北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)。試劑盒采用晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒[中國(guó)衛(wèi)生部-比爾和梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治合作項(xiàng)目(簡(jiǎn)稱“中蓋結(jié)核病項(xiàng)目”) 免費(fèi)提供]。

1.檢測(cè)標(biāo)本：對(duì)痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本或培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。

2.檢測(cè)方法：采用N-乙酰左旋半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)方法對(duì)痰涂片標(biāo)本進(jìn)行前處理，基因芯片的檢測(cè)按照中蓋結(jié)核病項(xiàng)目提供的《基因芯片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進(jìn)行。基因芯片檢測(cè)操作過(guò)程中的DNA置-20 ℃保存，用于無(wú)結(jié)果時(shí)重復(fù)操作及后續(xù)的DNA復(fù)核。芯片耐藥性檢測(cè)結(jié)果可判定為結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH和RFP敏感、單耐INH、單耐RFP、耐多藥。

3. 判定方法：若耐藥非高危人群第1次基因芯片檢測(cè)結(jié)果為RFP耐藥時(shí)，需采用該患者的另1份涂陽(yáng)或培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行第2次基因芯片檢測(cè)。2次基因芯片檢測(cè)結(jié)果均顯示為RFP耐藥時(shí)，判定患者為RFP耐藥。當(dāng)2次基因芯片檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，判定該患者為RFP敏感。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種方法不同耐藥類型的檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果推斷單耐RFP率為 5.00%(14/280)，單耐INH率為5.71%(16/280)，耐多藥率為3.57%(10/280)。對(duì)280份標(biāo)本同時(shí)采用基因芯片檢測(cè)技術(shù)(簡(jiǎn)稱“基因芯片”)和傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。基因芯片與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)比較檢測(cè)RFP耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16，P>0.05)；對(duì)INH耐藥率檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.33，P>0.05)；耐多藥耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P>0.05)(表1)。

280份標(biāo)本采用兩種方法檢測(cè)對(duì)RFP耐藥的一致性情況進(jìn)行分析，有4份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)RFP敏感但基因芯片未檢測(cè)出結(jié)果；有2份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)RFP耐藥而基因芯片檢測(cè)為敏感；有1份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)RFP敏感而基因芯片診斷為耐多藥。在檢測(cè)的280例患者中有273例患者的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，一致率為97.50%。

表1 兩種耐藥檢測(cè)方法對(duì)FRF和INH耐藥的檢測(cè)結(jié)果

280份標(biāo)本采用兩種方法檢測(cè)對(duì)INH耐藥的一致性情況進(jìn)行分析，有5份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)INH敏感但基因芯片未檢測(cè)出；有3份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)INH耐藥而基因芯片檢測(cè)為敏感；有1份傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)INH敏感而基因芯片檢測(cè)為耐多藥。在檢測(cè)的280例患者中有271例患者的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，一致率為96.78%。

在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷單耐RFP的14份標(biāo)本中，基因芯片診斷出12份；在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷為RFP敏感的266份中，基因芯片診斷出261份，因此基因芯片診斷單耐RFP的敏感度為85.71%(12/14)，特異度為98.12%(261/266)。

在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷單耐INH的16份標(biāo)本中，基因芯片診斷出13份；在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷為INH敏感的264份中，基因芯片診斷出258份，因此基因芯片診斷單耐INH的敏感度為81.25%(13/16)，特異度為97.73%(258/264)。

在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷耐多藥的10份標(biāo)本中，基因芯片診斷出10份；在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)診斷為非耐多藥的270份標(biāo)本中，基因芯片診斷出269份，因此基因芯片診斷耐多藥的敏感度為100.00% (10/10)，特異度為99.63%(269/270)。

二、 痰涂片及分離株兩種標(biāo)本行基因芯片的檢測(cè)結(jié)果

痰涂片標(biāo)本行基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，單耐RFP率為 4.11%(9/219)，單耐INH率為4.57%(10/219)，耐多藥率為3.65%(8/219)。 分離株標(biāo)本行基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，單耐RFP率為 4.92%(3/61)，單耐INH 率為4.92%(3/61)，耐多藥率為4.92%(3/61)。痰涂片標(biāo)本及分離菌株標(biāo)本行基因芯片檢測(cè)單耐RFP率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.08，P>0.05)，兩種標(biāo)本行基因芯片檢測(cè)單耐INH率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.01，P>0.05)，耐多藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.20，P>0.05)(表2)。

討 論

傳統(tǒng)診斷耐藥結(jié)核病的方法是采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)并通過(guò)藥敏試驗(yàn)測(cè)定證實(shí)[2-3]。該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，但從培養(yǎng)到得出藥敏試驗(yàn)結(jié)果常常需要2～3個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，難以滿足耐藥結(jié)核病的早期診斷，一定程度上延誤了對(duì)耐藥結(jié)核病患者的治療。

世界衛(wèi)生組織[4]在《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理(PMDT)指南(2011年更新版)》提出：耐藥結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)是在制訂耐藥結(jié)核病檢查和治療策略時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素之一。 因此，推薦開(kāi)展對(duì)INH和RFP或RFP的快速藥敏試驗(yàn)，以替代傳統(tǒng)試驗(yàn)或在診斷結(jié)核病時(shí)不進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的模式。而在2 d內(nèi)達(dá)到早期診斷，完成對(duì)INH和RFP的耐藥性檢測(cè)，只有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)才能達(dá)到此目的。

宜昌市是中蓋結(jié)核病項(xiàng)目二期全國(guó)3個(gè)試點(diǎn)地區(qū)之一(于2013年7月正式啟動(dòng))，該項(xiàng)目最大的特點(diǎn)是“三新一加強(qiáng)”?！叭隆笔侵感碌膶?shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)、新的患者管理技術(shù)和新的經(jīng)費(fèi)籌資模式；“一加強(qiáng)”是指加強(qiáng)結(jié)核病防治服務(wù)體系。其中新的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)是“基因芯片法快速耐藥結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)”。 該方法利用結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒和相關(guān)儀器通過(guò)核酸提取、PCR擴(kuò)增、芯片雜交與清洗、芯片掃描等過(guò)程,分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH和RFP耐藥的相關(guān)基因KatG、inhA和rpoB常見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷是否耐藥，可以在6 h內(nèi)得到結(jié)果[5]。

本研究結(jié)果顯示，基因芯片檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)比較檢測(cè)RFP耐藥與否的結(jié)果一致率為 97.50%，檢測(cè)INH的結(jié)果一致率均為96.78%。診斷單耐INH的敏感度為81.25%，特異度為97.73%。診斷單耐RFP的敏感度為85.71%，特異度為98.12%。診斷耐多藥的敏感度為100.00%，特異度為99.63%。與趙冰等[6]采用基因芯片法結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)對(duì)INH、RFP是否耐藥的結(jié)果接近。從表2結(jié)果顯示，痰涂片標(biāo)本及分離菌株標(biāo)本行基因芯片法技術(shù)檢測(cè)單耐RFP率、單耐INH率、耐多藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示基因芯片耐藥檢測(cè)技術(shù)對(duì)痰涂片標(biāo)本及分離菌株標(biāo)本均有相似的檢測(cè)效果。

表2 兩種不同來(lái)源標(biāo)本進(jìn)行基因芯片檢測(cè)結(jié)果

在《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南(2011年更新版)》中，世界衛(wèi)生組織推薦的兩種分子生物學(xué)技術(shù)為線性探針和Xpert Mtb/RIF技術(shù)[4]。其中線性探針技術(shù)同樣是通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的。據(jù)國(guó)內(nèi)黃玉平等[7]報(bào)道，采用線性探針技術(shù)檢測(cè)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)比較，二者檢測(cè)的耐RFP一致率達(dá)98%，耐INH結(jié)果一致率為97%；診斷耐RFP的敏感度為82.8%，特異度為99.3%；診斷耐INH的敏感度為80.4%，特異度為99.3%。筆者采用與線性探針技術(shù)相似的基因芯片法檢測(cè)技術(shù)所得的檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)[7]的報(bào)告大致相似。以上均提示，在現(xiàn)有條件下采用基因芯片技術(shù)對(duì)RFP和INH耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的敏感度和特異度。

按照本研究所得的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，宜昌地區(qū)單耐RFP率為 5.00%，單耐INH率為5.71%，耐多藥率為3.57%，與2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查的報(bào)告結(jié)果相比較，單耐INH率、耐多藥率低于全國(guó)水平[8]，提示本地區(qū)結(jié)核病規(guī)劃治療管理取得了一定的效果。由于本研究的患者例數(shù)較少，也可能不足以反映當(dāng)?shù)氐慕Y(jié)核病疫情情況。

值得一提的是，在我院診斷為耐多藥的1例患者屬于非耐藥高危者，行2次基因芯片檢測(cè)均提示為同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥；但傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)提示為對(duì)INH和RFP均敏感。兩種方法有明顯差別的可能原因如下：(1)作為一種快速檢測(cè)方法，基因芯片法檢測(cè)結(jié)果本身就未能達(dá)到100%的準(zhǔn)確率。(2)晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒由于對(duì)位點(diǎn)檢測(cè)及后續(xù)雜交的特異性問(wèn)題，也存在將野生型誤判為突變型的可能，有學(xué)者曾有相關(guān)報(bào)道[9]。(3)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果受到多種因素影響，結(jié)核分枝桿菌菌懸液含菌量對(duì)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)有一定影響。含菌量越少，檢測(cè)結(jié)果的敏感率越高；而含菌量越高，檢測(cè)結(jié)果的耐藥率也高[10]。對(duì)于此種情況，筆者認(rèn)為盡管傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為判斷耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍應(yīng)再次行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，盡量考慮和避免傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)可能出現(xiàn)誤差的各個(gè)環(huán)節(jié)，不能輕易否定基因芯片技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果；有條件時(shí)更應(yīng)該對(duì)患者進(jìn)行耐藥相關(guān)基因的測(cè)序，以進(jìn)一步判斷檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并復(fù)檢該菌株表型的耐藥性。如果基因芯片檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果有差異，應(yīng)采用基因芯片技術(shù)反復(fù)檢測(cè)3次，以進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

筆者所在的宜昌市也為第五輪中國(guó)全球基金耐多藥結(jié)核病防治項(xiàng)目湖北省二期所在地區(qū)，該項(xiàng)目采用的耐藥結(jié)核病診斷方法為傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)，從培養(yǎng)到得出藥敏試驗(yàn)結(jié)果常常需要2～3個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。相比較而言，中蓋結(jié)核病項(xiàng)目開(kāi)展的基因芯片檢測(cè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)所需時(shí)間短，而且對(duì)于RFP和INH耐藥性診斷方面具有較高的敏感度和特異度，因此可為耐藥結(jié)核病的診斷提供有力依據(jù)。這對(duì)實(shí)現(xiàn)耐藥結(jié)核病的早期診斷、早期治療具有重要參考價(jià)值。

[1] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程.中國(guó)防癆雜志，1996,18(1)：28-31.

[2] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì).耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2015). 中國(guó)防癆雜志,2015，37(5)：421-469.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范·結(jié)核病分冊(cè). 北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：29-46.

[4] 世界衛(wèi)生組織.耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南(2011年更新版).日內(nèi)瓦：世界衛(wèi)生組織，2011：13-15.

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[8] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中國(guó)防癆雜志,2012，34(8)：485-508．

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[10] 黎友倫,陳保文,沈小兵,等.結(jié)核分枝桿菌接種菌量對(duì)異煙肼和利福平藥敏試驗(yàn)的影響.中國(guó)防癆雜志,2006，28(5)：288-291．

(本文編輯：范永德)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.019

443003 湖北省宜昌市第三人民醫(yī)院結(jié)核科

何建，Email: hejian0914@sina.com

2015-06-11)