邱磊

MiR－375增加腫瘤壞死因子對人口腔鱗癌細胞殺傷活性及機制研究

邱磊

目的 探討microRNA－375（miR－375）對腫瘤壞死因子（TNF－α）殺傷人口腔鱗癌細胞生物效應(yīng)的影響。方法 將人口腔鱗癌細胞Cal27用miR－375模擬物轉(zhuǎn)染后用TNF－α治療，采用MTT法檢測治療后Cal27細胞的增殖情況；通過流式細胞術(shù)檢測Cal27細胞治療后的凋亡情況;通過流式細胞術(shù)檢測Cal27細胞內(nèi)DNA的含量，測定凋亡特征性subG1期的細胞比值；定量PCR法檢測治療后Cal27細胞抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－xl、cIAP2、cFLIPL的表達。結(jié)果 miR－375+TNF－α組對Cal27細胞增殖的抑制率為（37.8±5.2）%，凋亡率為（20.5±3.8）%，TNF－α組分別為（6.2±2.7）%、（1.0±0.3）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR－375+TNF－α組，Cal27細胞的cIAP2、cFLIPL表達較TNF－α組顯著下降（2.15±0.16比6.87±0.42、1.54±0.10比3.98±0.25）（P＜0.05），Bcl－2，Bcl－xl表達不變。結(jié)論 miR－375降低cIAP2、cFLIPL的表達，提高人口腔鱗癌Cal27細胞對TNF－α的敏感性，提高凋亡率。

人口腔鱗癌細胞Cal27；miR－375；TNF－α；細胞凋亡；cIAP2；cFLIPL

腫瘤壞死因子（TNF－α）是一種炎癥細胞因子并且具有抗腫瘤的作用[1]，大劑量TNF－α有較好的抗腫瘤療效，但大劑量TNF－α毒副作用也大，患者往往無法耐受，所以提高腫瘤細胞對TNF－α的敏感性以降低TNF－α的劑量，將提高TNF－α的臨床應(yīng)用前景。Mir－375是microRNA家族中的一員，文獻[2－3]報道，腫瘤細胞中轉(zhuǎn)染MiR－375模擬物可以降低腫瘤細胞的增殖，目前尚無將MiR－375作為藥物增敏劑的報道。為此，筆者應(yīng)用TNF－α治療用miR－375轉(zhuǎn)染后的人口腔鱗癌細胞Cal27，觀察miR－375能否提高口腔鱗癌細胞對TNF－α的敏感性，使低劑量的TNF－α呈現(xiàn)出顯著殺傷腫瘤細胞的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人口腔鱗癌Cal27細胞系購自于美國ATCC（產(chǎn)品號：CRL－2095），培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基購自于Gibco公司，胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司，TNF－α、二甲亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）、碘化丙啶（PI）購于Sigm－Aldrich，PI和AnnexinⅤ凋亡試劑盒購自美國ebioscience，miR－375模擬物購于廣州銳博生物有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、Trizol購自Invitrogen公司，實時熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TOYOBO公司，SYBR Green購于TaKaRa。

1.3 MTT試驗 將Cal27細胞按1×103/孔接種于96孔板，加入200μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個復(fù)孔，按Lipofectamine2000操作說明書在培養(yǎng)體系中分別加入0nM、40nM、0nM、40nM的miR－375模擬物培養(yǎng)48h，然后再分別加入0ng/mL、0ng/mL、10ng/mL、10ng/mL的重組TNF－α培養(yǎng)24h，之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞生長的抑制率以以下公式計算：抑制率=（OD對照組－OD實驗組）/ OD對照組×100%。

1.4 細胞凋亡試驗 按Lipofectamine2000操作說明書在Cal27細胞中分別加入 0nM、40nM、0nM、40nM的miR－375模擬物培養(yǎng)48h，然后再分別加入0ng/mL、0ng/mL、10ng/mL、10ng/mL的重組TNF－α培養(yǎng)24h，按照試劑說明書將PI和annexin－V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡。細胞凋亡性死亡率用PI、annexin－V雙陽性細胞占所有細胞比值表示。

1.5 細胞周期試驗 按Lipofectamine 2000操作說明書在Cal27細胞中分別加入 0nM、40nM，0nM、40nM的miR－375模擬物培養(yǎng)48h，然后再分別加入0ng/mL、0ng/mL、10ng/mL、10ng/mL的重組TNF－α培養(yǎng)24h，之后收集細胞用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗2次，用70%乙醇在4℃固定過夜，之后用PBS清洗1次，加入（50μg/mL）RNA酶，100μg/mL PI在暗處染色30min，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，檢測subG1期細胞所占比率。

1.6 定量PCR試驗 按Lipofectamine2000操作說明書在Cal27細胞中分別加入0nM、40nM、0nM、40nM的miR－375模擬物培養(yǎng)48h，然后再分別加入0ng/mL、0ng/mL、10ng/mL、10ng/mL的重組TNF－α培養(yǎng)24h，之后各組細胞用Trizol試劑裂解，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書制備cDNA，加SYBR Green按定量PCR的一般程序進行擴增。實驗數(shù)據(jù)用2－ΔΔCt法分析[4]，結(jié)果用實驗組與對照組目標基因表達量的相對值來表示，引物設(shè)計見表1。

2 結(jié)果

2.1 miR－375聯(lián)合TNF－α對Cal27細胞抑制作用用miR－375或10ng/mL的TNF－α單獨治療Cal27腫瘤細胞，對腫瘤細胞的抑制率分別為（4.1±2.1）%、（6.2±2.7）%。將Cal27細胞先用miR－375處理后再加TNF－α，腫瘤細胞抑制率提高至（37.8±5.2）%。與兩個單獨用藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）,見表2。

2.2 miR－375聯(lián)合TNF－α對Cal27細胞凋亡的誘導(dǎo)作用 單用miR－375或10ng/mL TNF－α幾乎不能誘導(dǎo)Cal27細胞進入凋亡性死亡，然而當miR－375合用TNF－α?xí)r，Cal27細胞發(fā)生了顯著性的凋亡。當細胞進入凋亡時，細胞內(nèi)通常DNA發(fā)生降解，細胞內(nèi)DNA含量低于G1期，在細胞周期圖上表現(xiàn)為subG1峰[5]。我們用流式細胞術(shù)PI染色法檢測Cal27細胞的細胞周期，發(fā)現(xiàn)Cal27細胞單用miR－375或10ng/mL的TNF－α治療時，subG1期細胞很少，然而當miR－375合用TNF－α治療Cal27細胞時，subG1期細胞顯著增加，見表2。

表1 RT－qPCR引物設(shè)計

表2 miR－375聯(lián)合TNF－α對Cal 27細胞抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用（±s）

表2 miR－375聯(lián)合TNF－α對Cal 27細胞抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與miR－375組和TNF－α組比較，△P＜0.01

組別對照組miR－375組TNF－α組miR－375+TNF－α組孔數(shù)3333 miR－375濃度（nM）0 40 0 40 TNF－α濃度（ng/mL）001 0 10抑制率（%）0 4.1±2.1 6.2±2.7* 37.8±5.2**△凋亡率（%）1.1±0.3 3.8±0.8* 1.0±0.3 20.5±3.8**△subG1期細胞比率（%）0.5±0.2 5.3±1.1* 0.6±0.1 27.4±3.1**△

表3 miR－375及TNF－α對Cal27細胞抗凋亡蛋白表達的影響（相對表達量，±s）

表3 miR－375及TNF－α對Cal27細胞抗凋亡蛋白表達的影響（相對表達量，±s）

注：與TNF－α組比較，*P＜0.05

組別對照組miR－375組TNF－α組miR－375+TNF－α組孔數(shù)3333 miR－375濃度（nM）0 40 0 40 TNF－α濃度（ng/mL）001 0 10 Bcl－2 1.0±0.02 0.98±0.04 1.56±0.08 1.40±0.13 Bcl－xl 1.0±0.03 1.03±0.02 1.87±0.11 1.90±0.14 cIAP2 1.0±0.02 0.88±0.03 6.87±0.42 2.15±0.16* cFLIPL 1.0±0.04 0.72±0.03 3.98±0.25 1.54±0.10*

2.3 miR－375調(diào)控抗凋亡蛋白cIAP2和cFLIPL的表達 在細胞培養(yǎng)體系中單用TNF－α可誘導(dǎo)Cal27細胞Bcl－2、Bcl－xl、cIAP2和cFLIPL的表達，而與miR－375合用相比于單用TNF－α，細胞內(nèi)cIAP2和cFLIPL的表達顯著下降（P＜0.05），但對Bcl－2和Bcl－xl的表達沒有影響，見表3。

3 討論

microRNA（miRNA）是細胞內(nèi)自然存在的一種非蛋白編碼的小RNA，長度約為19～25個堿基，它能與有互補序列的mRNA特異性結(jié)合并造成該mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯，從而調(diào)節(jié)細胞的蛋白表達[6]，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與正常細胞相比，miRNA的表達往往發(fā)生改變以促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[7－8]。MicroRNA－375是細胞內(nèi)源性的蛋白表達調(diào)節(jié)因子，最早研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖通過信號途徑下調(diào)miR－375的轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)胰島細胞分泌胰島素并促進胰島細胞的增殖[9]。后來研究則發(fā)現(xiàn)了miR－375在多種腫瘤模型特別是鱗狀細胞癌中含量均顯著下調(diào)，當在鱗狀細胞癌中轉(zhuǎn)染miR－375模擬物后，腫瘤的生長受到抑制，證實了腫瘤的發(fā)生與miR－375的減少有關(guān)[10－11]。這些研究表明miR－375具有抗腫瘤的作用，可能成為一種潛在的腫瘤治療手段和腫瘤治療預(yù)后的指標。TNF－α是一種十分強力的腫瘤抑制性細胞因子，能與細胞的死亡受體結(jié)合并打開線粒體膜通道釋放細胞色素C等凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)，并造成腫瘤細胞死亡[12]。但是低劑量的TNF－α能激活核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，從而誘導(dǎo)細胞抗凋亡蛋白如Bcl－2、Bcl－xl、cIAP2和cFLIPL的表達，促進腫瘤細胞的增殖[13－15]。因此，我們必須加大TNF－α的用藥劑量。然而臨床上也發(fā)現(xiàn)大劑量的TNF－α對機體有較大毒性反應(yīng)，因此找到一種化學(xué)增敏劑來提高TNF－α殺傷腫瘤細胞的能力并降低TNF－α的使用劑量減少毒副反應(yīng)具有十分重要的意義。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)miR－375能通過下調(diào)抗凋亡蛋白cIAP2和cFLIPL的表達來提高TNF－α對Cal27的殺傷活性，同時兩者聯(lián)合應(yīng)用也大大提高TNF－α對Cal27的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。研究結(jié)果提示miR－375聯(lián)合TNF－α可能在人口腔鱗癌輔助治療中有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿：2014－08－19 修回：2014－10－14）

MiR-375 Increases The Cytotoxicity of Tumor Necrosis Factor in Oral Squamous Cells and Its Mechanism

Qiu Lei.Ningbo Maternal and Child Health Hospital of Beilun,NingBo(315800),China

Objective To explore the effect of miR－375 on the proliferation of Cal27 cells treated with tumor necrosis factor α（TNF－α）and its mechanism.Methods Cal27 cells were transfected with miR－375 mimic and then treated with TNF－α.Cell proliferation was measured by using the MTT assay.Apoptosis of tumor cells and subG1 peak were determined by flow cytometry.The expression of anti－apoptosis proteins Bcl－2,Bcl－xl,cIAP2 and cFLIPL were evaluated by qPCR.Results MiR－375 mimic combined with TNF－α increased inhibition rate of Cal27 cell proliferation（37.8±5.2）and inhibition rate of Cal27 cell apoptosis（20.5±3.8）compared with TNF－α alone group（6.2±2.7,1.0±0.3）,both with significant difference（P all＜0.05）.The expression of cIAP2 and cFLIPL in Cal27 cells treated with miR－375 mimic and TNF－α significantly decreased（2.15±0.16 vs 6.87±0.42;1.54±0.10 vs 3.98±0.25;P all＜0.05）,while the expression of Bcl－2,Bcl－xl remained unchanged.Conclusion MiR－375 may enhance the sensitivity of Cal27 cells toward TNF－α via decreasing the expression of cIAP2 and cFLIPL.

human oral squamous carcinoma cell；Cal27；miR－375；TNF－α；apoptosis；cIAP2；cFLIPL

浙江省寧波市北侖區(qū)婦幼保健院檢驗科（寧波 315800）