陳虹

黃芩素對(duì)人膽囊癌細(xì)胞系SGC996細(xì)胞活力及細(xì)胞鋅指X染色體蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

陳虹

目的 探討中藥黃芩提取物黃芩素對(duì)人膽囊癌的生物效應(yīng)及機(jī)制。方法 將人膽囊癌細(xì)胞系SGC996用黃芩素處理48h，采用MTT法檢測治療后SGC996的細(xì)胞活力；通過對(duì)透過transwell膜的SGC996細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，評(píng)估黃芩素對(duì)膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測黃芩素處理后，SGC996細(xì)胞的凋亡情況，并用Western blot方法檢測細(xì)胞鋅指X染色體蛋白（ZFX）的表達(dá)。結(jié)果 40、80、160、320μmol/L黃芩素組對(duì)SGC996細(xì)胞活力的抑制率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [（19.3±3.8）%、（37.9±5.8）%、（61.6±7.8）%、（84.2±10.2）%比0，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黃芩素組對(duì)SGC996細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [（7.5± 1.2）%、（16.3±1.9）%、（31.2±2.8）%比（0.5±0.5）%，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黃芩素組對(duì)SGC996細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（25.6±6.6）%、（57.3±7.9）%、（84.1±11.9）%比0，P＜0.05]。Western blot結(jié)果顯示，黃芩素對(duì)ZFX有顯著的抑制作用。結(jié)論 黃芩素有良好的抗膽囊癌生物活性，其抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制可能與下調(diào)ZFX蛋白表達(dá)有關(guān)。

人膽囊癌細(xì)胞系；SGC996；黃芩素；細(xì)胞鋅指X染色體蛋白；細(xì)胞活力

膽囊癌是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，具有腫瘤早期即發(fā)生淋巴結(jié)侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的特征，較難治愈[1-2]。早期膽囊癌患者往往無癥狀或僅為輕微腹部不適，約90%的患者在確診為膽囊癌時(shí)已進(jìn)入中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)[3]。因此，藥物治療是目前治療膽囊癌的主要手段。黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏，抗菌，抗病毒的功效，研究還發(fā)現(xiàn)黃芩素可能有抗腫瘤的作用[4]，因此本研究的目的在于探討黃芩素對(duì)膽囊癌的抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膽囊癌SGC996細(xì)胞系來源于上海中科院細(xì)胞庫，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司。黃芩素，噻唑藍(lán)（MTT），AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒購于美國Sigma公司。細(xì)胞鋅指X染色體蛋白（ZFX）抗體及β-actin抗體購于美國cell signaling公司。ZFX siRNA合成于廣州銳博生物有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。BCA試劑盒和ECL試劑盒購于美國Pierce公司。

1.3 MTT試驗(yàn) 將SGC996細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并分別以10、20、40、80、160、320μmol/L的黃芩素培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加黃芩素同樣條件培養(yǎng)48h。之后加20μL 5mg/mL MTT培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD黃芩素組）/OD對(duì)照組×100%。

1.4 SGC996細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測 在transwell小室中接種1×104個(gè)SGC996細(xì)胞置于24孔板中，上室培養(yǎng)基為無血清DMEM培養(yǎng)基并分別加入40、80、160μmol/L黃芩素，下室培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后取出transwell小室，用生理鹽水洗去小室內(nèi)的細(xì)胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定 15min后用 0.1%結(jié)晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。SGC996細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目-黃芩素組細(xì)胞數(shù)目）/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) SGC996細(xì)胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測。在SGC996細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入40、80、160μmol/L黃芩素培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加黃芩素同樣條件培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，生理鹽水清洗一次，按照試劑說明書將PI和Annexin V加入細(xì)胞中孵育20min，用生理鹽水清洗3次后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡率用Annexin V陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示。

1.6 Western blot試驗(yàn) 在SGC996細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入40、80、160μmol/L黃芩素培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加黃芩素同樣條件培養(yǎng)48h，細(xì)胞裂解后用BCA試劑盒進(jìn)行定量，取50μg蛋白質(zhì)在12.5%的丙烯酰胺中進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在ZFX一抗或β-actin一抗中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X膠片，以ZFX與β-actin蛋白條的灰度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ZFX siRNA序列為：正向：5'-ACAAGGAUCAAUUUCCGACUU-3'；反向：5'-GUCGGAAAUUGAUCCUUGUUU-3'。無關(guān)RNA序列為正向：5'-ACCGUGGAUAAUCACCAAUUU-3'；反向：5'-AUUGGUGAUUAUCCACGGUUU-3'。待SGC996細(xì)胞生長到80%密度時(shí)按Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書要求將100nmol/L的ZFX siRNA或無關(guān)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染入SGC996細(xì)胞中培養(yǎng)16h，之后換新鮮培養(yǎng)基并加入40μmol/L的黃芩素再培養(yǎng)48h，檢測細(xì)胞活力、凋亡水平和細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)膽囊癌細(xì)胞系SGC996細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果表明黃芩素在體外濃度達(dá)到40μmol/L以上時(shí)即顯示顯著的抗膽囊癌效應(yīng)（P＜0.05），提示黃芩素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用且呈劑量依賴性，見表1。

表1 不同濃度黃芩素對(duì)SGC996細(xì)胞活力的影響（±s）

表1 不同濃度黃芩素對(duì)SGC996細(xì)胞活力的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

對(duì)照組10μmol/L黃芩素組20μmol/L黃芩素組40μmol/L黃芩素組80μmol/L黃芩素組160μmol/L黃芩素組320μmol/L黃芩素組3 3 3 3 3 3 3 0 10 20 40 80 160 320 0 0.4±0.9 4.2±1.5 19.3±3.8* 37.9±5.8* 61.6±7.8* 84.2±10.2*

2.2 黃芩素對(duì)膽囊癌細(xì)胞系SGC996侵襲轉(zhuǎn)移能力及凋亡程度的影響 transwell實(shí)驗(yàn)和凋亡檢測實(shí)驗(yàn)表明黃芩素能顯著降低SGC996的轉(zhuǎn)移能力并誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生凋亡（P＜0.05），見表2。

2.3 黃芩素下調(diào)膽囊癌細(xì)胞系SGC996ZFX蛋白表達(dá) 黃芩素可顯著下調(diào)SGC996ZFX蛋白的表達(dá)水平，見圖1。為了研究ZFX蛋白與黃芩素抗膽囊癌效應(yīng)的關(guān)系，我們應(yīng)用小RNA（siRNA）基因沉默技術(shù)，下調(diào)SGC996細(xì)胞的ZFX水平，并將40μmol/L黃芩素加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，檢測ZFX基因沉默后黃芩素對(duì)SGC996細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染ZFX siRNA也能抑制SGC996的細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而ZFX siRNA聯(lián)合黃芩素則可發(fā)揮協(xié)同作用，顯著殺傷SGC996細(xì)胞，見表3。

表2 黃芩素體外對(duì)SGC996侵襲轉(zhuǎn)移能力及凋亡程度的影響（±s）

表2 黃芩素體外對(duì)SGC996侵襲轉(zhuǎn)移能力及凋亡程度的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組40μmol/L黃芩素組80μmol/L黃芩素組160μmol/L黃芩素組孔數(shù)3 3 3 3黃芩素濃度（μmol/L）0 40 80 160轉(zhuǎn)移抑制率（%）0 25.6±6.6* 57.3±7.9* 84.1±11.9*凋亡誘導(dǎo)率（%）0.5±0.5 7.5±1.2* 16.3±1.9* 31.2±2.8*

表3 ZFX siRNA對(duì)黃芩素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表3 ZFX siRNA對(duì)黃芩素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，#P＜0.05；與ZFX siRNA組比較，△P＜0.05；ZFX：細(xì)胞鋅指X染色體蛋白

組別對(duì)照組黃芩素組ZFX siRNA組ZFX siRNA聯(lián)合黃芩素組孔數(shù)ZFX siRNA（nmol/L）3 3 3 3 0 0無關(guān)siRNA（nmo/L）100 100 100 100 0 0黃芩素濃度（μmol/L）0 40 0 40細(xì)胞活力抑制率（%）0 17.8±2.5* 20.6±4.4* 74.3±6.2*#△轉(zhuǎn)移抑制率（%）0 26.8±5.9* 37.1±6.9* 90.4±15.2*#△凋亡誘導(dǎo)率（%）0.6±0.3 7.1±1.1* 12.3±2.2* 38.2±4.1*#△

圖1 黃芩素對(duì)SGC996 ZFX表達(dá)水平的影響注：1.對(duì)照組；2.40μmol/L黃芩素組；3.80μmol/L黃芩素組；4.160μmol/L黃芩素組；ZFX：細(xì)胞鋅指X染色體蛋白

3 討論

黃芩素是目前廣泛使用的天然藥物活性成分，毒副作用較小，它良好的抗腫瘤效應(yīng)越來越被重視。研究[5]表明黃芩素可顯著下調(diào)口腔癌細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞的增殖；黃芩素還可明顯降低DMBA-TPA對(duì)小鼠皮膚癌的誘導(dǎo)作用[6]；此外，黃芩素還能在體外顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[7]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩素具有顯著的體外抗膽囊癌效應(yīng)，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力并誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

鋅指X染色體蛋白（ZFX）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，基因位于X染色上。ZFX調(diào)控細(xì)胞的自我更新，在正常情況下維持胚胎和造血干細(xì)胞的分裂增殖[8]。研究發(fā)現(xiàn)ZFX在多種腫瘤細(xì)胞，如肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并幫助細(xì)胞逃避凋亡信號(hào)[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著下調(diào)ZFX的表達(dá)水平，推斷黃芩素抗膽囊癌的機(jī)制可能和ZFX有關(guān)。為了研究ZFX在膽囊癌中的作用，我們用siRNA對(duì)ZFX基因進(jìn)行沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFX siRNA有類似黃芩素的抗SGC996作用，而將ZFX siRNA和黃芩素同時(shí)作用于SGC996細(xì)胞時(shí)，腫瘤細(xì)胞的活力和轉(zhuǎn)移能力受到極大的抑制，細(xì)胞凋亡程度顯著提高，表明兩者有協(xié)同作用。這些結(jié)果都支持了黃芩素殺傷SGC996細(xì)胞依賴于ZFX的下調(diào)這一觀點(diǎn)。綜上所述，本研究結(jié)果提示黃芩素有潛在的抗膽囊癌生物效應(yīng)，其機(jī)制可能為下調(diào)細(xì)胞內(nèi)鋅指X染色體蛋白的表達(dá)水平，為膽囊癌的藥物治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

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（收稿：2015-02-04 修回：2015-03-06）

Effect of Baicalein on Cell Activity and the Expression of ZFX Protein in Human Gallbladder Cancer CellLine SGC996

CHEN Hong.Department of Pharmacy,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To explore the effect of baicalein extracted from Scutellaria Baicalensis Georgi on gallnladder cercinoma and the underlying mechanism.M ethods SGC996 cells were treated with baicalein for 48 h and then were detected for cell viability by MTT assay.Cancer metastasis was evaluated by transwell assay.The apoptosis of SGC996 cells was measured by flow cytometry.The expression of ZFX protein in baicalein-treating SGC996 cells was detected with western blot.Results The cell viability inhibitory rate of SGC996 cells in 40,80, 160,and 320μmol/L baicalein groups were 19.3%±3.8%,37.9%±5.8%,61.6%±7.8%,and 84.2%±10.2%,with a significant difference as compared with control group（0,P＜0.05）.The apoptosis rate of SGC996 cells in control group and 40,80,and 160μmol/L baicalein groups were 0.5%±0.5%,7.5%±1.2%,16.3%±1.9%,and 31.2%±2.8%（P＜0.05）;the inhibitory rate of metastasis in these groups were 0,25.6%±6.6%,57.3%±7.9%,84.1%±11.9%（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of ZFX protein in SGC996 cells was significantly suppressed by baicalein.Conclusion Baicalein showed a significant anti-tumor effect on human gallbladder cancer. The mechanism may be due to the down-regulation of ZFX.

human gallbladder cancer cell line;SGC996;baicalein;ZFX;cell viability

杭州市第一人民醫(yī)院藥劑科（杭州 310006）