張玉園　杜清葉

[摘 要] 香石竹莖尖試管苗繼代培養(yǎng)玻璃化現(xiàn)象是香石竹脫毒試管苗生產(chǎn)的一個(gè)主要障礙。為探討不同培養(yǎng)條件對(duì)香石竹組培苗玻璃化的影響，以香石竹健壯組培苗為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度6-BA、蔗糖和瓊脂以及添加活性炭對(duì)防止香石竹組培苗玻璃化現(xiàn)象的作用。結(jié)果表明，降低6-BA的濃度，適當(dāng)提高蔗糖和瓊脂的濃度，組培苗增殖系數(shù)較高，玻璃化率低。其中，MS+蔗糖30.0 g+瓊脂8.0 g+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+活性炭4 g/L的培養(yǎng)基可以有效降低香石竹組織培養(yǎng)中的玻璃化現(xiàn)象。

[關(guān)鍵詞] 香石竹 繼代培養(yǎng) 玻璃化

Abstract： Vitrification is the main obstacle in subculture of carnation plantlets in vitro，which were induced from shoot tips. In order to study the influence of different culture conditions on the carnation somaclone vitrification， with robust carnation somaclone as material， taking MS as the basic culture medium， the effects of different concentrations of 6-BA， sugar and agar and active carbon added on prevention of carnation plantlets vitrification phenomenon were tested. The results showed that low concentration of 6-BA and properly increasing the concentration of sugar and agar， in which somaclone multiplication coefficient is higher and the vitrification rate is low. Therefore， medium with MS+sucrose 30.0 g+agar 8.0 g+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+ activated carbon 4 g/L can effectively prevent carnation vitrification in tissue culture.

Key words： Carnation， Subculture， Vitrification

[中圖分類號(hào)] S681.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2015）11-0090-02

香石竹（Dianthus caryophyllus L.），石竹科石竹屬，原產(chǎn)于歐洲南部，現(xiàn)世界各地廣泛栽培，我國(guó)上海、北京、廣州等地區(qū)栽培面積較大。香石竹單朵花期較長(zhǎng)，花朵雍容富麗，色彩絢麗嬌艷，耐瓶插，宜制作花束、花籃，觀賞價(jià)值極高，是世界著名的四大切花之一[1]。傳統(tǒng)生產(chǎn)香石竹主要依靠扦插、分株繁殖，但難以達(dá)到大量快速繁殖的目的，并且經(jīng)過(guò)多代繁殖的植株在這種長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖過(guò)程中，體內(nèi)會(huì)積累大量的病毒原，極易受到病毒侵染，使種源不斷退化，嚴(yán)重影響植株的健壯生長(zhǎng)[2，3]。近年來(lái)我國(guó)香石竹組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究開(kāi)展較早，取得了不少研究成果[4]。然而，盡管香石竹獲得再生比較容易，但其再生苗比較纖弱、易發(fā)生玻璃化，在植物組織培養(yǎng)中組培苗玻璃化現(xiàn)象及其容易發(fā)生，已報(bào)道的植物多達(dá)70種[5]。由于玻璃苗的組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，故增殖系數(shù)低，生根較難，移栽大田難以成活，是植物組織培養(yǎng)的一大難題[6-8]。如何改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)克服玻璃化等問(wèn)題，是其研究和需克服的難點(diǎn)。

本研究以生長(zhǎng)健壯的正常莖尖組培苗為材料，采用單因素隨機(jī)變量法，初步研究6-BA、瓊脂、蔗糖、活性炭等不同組培條件下對(duì)莖尖組培苗繼代培養(yǎng)過(guò)程中玻璃化現(xiàn)象發(fā)生的情況，以期為獲得大量的香石竹試管苗及改善其質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為健壯的香石竹組培苗。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)處理

取健壯的香石竹組培苗，以MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8～6.0，每處理接種20瓶，每瓶3株苗，重復(fù)3次，接種后放置在光照強(qiáng)度為： 1000～2000 lx；光照時(shí)數(shù)12 h/d；培養(yǎng)在（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)30 d。

試驗(yàn)在基本培養(yǎng)基上分別設(shè)置下列4種處理，并對(duì)各因子進(jìn)行探討，探討加入不同量的各因子對(duì)香石竹的玻璃化現(xiàn)象的影響，各處理設(shè)置如下：

1.2.1.1 6-BA濃度對(duì)組培苗玻璃化的影響。 基本培養(yǎng)基：MS+NAA 0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8.0 g/L；6-BA 濃度分為5個(gè)水平：0、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L。

1.2.1.2瓊脂用量對(duì)組培苗玻璃化的影響。 基本培養(yǎng)基： MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L+蔗糖30.0 g/L瓊脂濃度分為4個(gè)水平：4.0、6.0、8.0、10.0 g/L。

1.2.1.3蔗糖濃度對(duì)組培苗玻璃化的影響。 基本培養(yǎng)基： MS+6-BA 0.5 mg/ L+NAA 0.01 mg/L+瓊脂8.0 g/L； 蔗糖處理濃度分為5個(gè)水平：10.0、20.0、30.0、40.0 、50.0 g/L。

1.2.1.4活性炭對(duì)組培苗玻璃化的影響。 培養(yǎng)基為： MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.01 mg/L+蔗糖30.0 g/L+ 瓊脂8.0g/L；活性炭處理濃度分為4個(gè)水平：0、2.0、4.0、6.0 g/L

1.2.2 記錄結(jié)果

接種30 d后觀察組培苗的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)組培苗的玻璃化情況，獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，玻璃化率按照下列方法進(jìn)行計(jì)算：

玻璃化率%=玻璃化苗數(shù)/分化數(shù)×100%

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Duncans多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA對(duì)莖尖組培苗繼代培養(yǎng)玻璃化的影響

由表1中可知，在添加0.01 mg/L NAA的培養(yǎng)基中附加不同濃度的6-BA，6-BA對(duì)香石竹組培苗玻璃化的影響非常顯著。隨著6-BA濃度的增加，玻璃化苗數(shù)隨之增加，6-BA濃度與玻璃化苗數(shù)呈正比例關(guān)系。當(dāng)培養(yǎng)基中不含6-BA時(shí)，香石竹無(wú)玻璃化現(xiàn)象，但組培苗不分化，生長(zhǎng)點(diǎn)生長(zhǎng)緩慢，成苗率極低。添加0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的6-BA組培苗的玻璃化率分別為12.8%、17.8%、62.7%和86.7%，與不添加6-BA的玻璃化率差異均達(dá)到0.01顯著水平。在6-BA濃度為0.2 mg/L和0.5 mg/L時(shí)，玻璃化率相差不大，苗的長(zhǎng)勢(shì)都表現(xiàn)良好，葉色濃綠，莖稈健壯，但6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，苗的分化率略高；當(dāng)6-BA濃度提高到 l.0 mg/L和2.0 mg/L時(shí)，組培苗的玻璃化率明顯升高，苗分化較多但葉片多表現(xiàn)為水浸狀，葉色較淡。綜上考慮，6-BA濃度為0.5 mg/L比較適宜。

2.2 瓊脂對(duì)香石竹組培苗玻璃化的影響

由表2可知，隨著瓊脂濃度的遞增，香石竹的玻璃化率逐漸降低。6.0、8.0、10.0 g/L的瓊脂濃度對(duì)香石竹的玻璃化較4.0 g/L瓊脂都有抑制作用，差異均達(dá)到0.01顯著水平。瓊脂濃度為4.0g/L時(shí)組培苗玻璃化率最高，達(dá)到43.9%，組培苗生長(zhǎng)較快，葉色微黃；在培養(yǎng)基中添加10.0 g/L的瓊脂時(shí)，玻璃化率最低，為零，能有效降低組培苗的玻璃化，但組培苗生緩慢，葉綠色。適量增加瓊脂濃度對(duì)克服玻璃苗有明顯效果，但過(guò)高濃度的瓊脂往往影響組培苗對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，不利于組培苗的生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基中以附加8.0 g/L瓊脂比較適宜，此時(shí)玻璃化率比較低，為24.5%，苗生長(zhǎng)正常，葉色濃綠。

2.3 蔗糖對(duì)香石竹組培苗玻璃化影響

由表3可知，香石竹的玻璃化率隨著蔗糖濃度的增加，呈明顯遞增趨勢(shì)。10.0、20.0 g/L蔗糖下的玻璃化率分別為27.2%、26.7%，差異不顯著，但組培苗的生長(zhǎng)勢(shì)較差，當(dāng)蔗糖濃度為10.0 g/L時(shí)，組培苗的葉色發(fā)黃，莖尖出現(xiàn)壞死現(xiàn)象；蔗糖濃度為30.0 g/L時(shí)，玻璃化率最低，為20.0%，與其他四種濃度處理的結(jié)果均達(dá)到0.01顯著水平，苗長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉色綠；30.0～50.0 g/L時(shí)，玻璃化率明顯提高；當(dāng)蔗糖濃度在50.0 g/L時(shí)，玻璃化率達(dá)到了52.2%，達(dá)到0.01顯著水平，此時(shí)組培苗生長(zhǎng)勢(shì)變差，葉色發(fā)黃，莖尖壞死現(xiàn)象較多。從本試驗(yàn)結(jié)果看出，在培養(yǎng)基中添加30.0g/L的蔗糖時(shí)，能有效改善組培苗的質(zhì)量。

2.4 活性炭（AC）對(duì)組培苗玻璃化的影響

從表4中可以看出，在培養(yǎng)基中添加活性炭可有效地降低組培苗的玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。在未添加活性炭的培養(yǎng)基（作對(duì)照）中，組培苗玻璃化率高，達(dá)到69.4%，與添加活性炭的培養(yǎng)基相比，差異顯著，均達(dá)到0.01顯著水平，同時(shí)組培苗分化略少，苗淡綠；而加入AC后，隨著AC濃度的升高，玻璃化率與對(duì)照相比顯著降低，差異均達(dá)到0.01顯著水平，同時(shí)苗分化較多。4.0、6.0g/L AC對(duì)組培苗玻璃化的抑制強(qiáng)度高，分別為39.4%、38.3%，比未添加AC分別降低了30.0%、31.1%，但兩者之間沒(méi)有顯著差異，同時(shí)6.0 g/L濃度下的苗分化較多，且較綠，是抑制組培苗玻璃化的適宜濃度。

3 討論與結(jié)論

香石竹組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象是許多因素綜合作用的結(jié)果，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)該綜合考慮各方面因素，選擇最佳的培養(yǎng)條件。6-BA對(duì)香石竹組培苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生的影響最為顯著， 增加培養(yǎng)基中6-BA的濃度，組培苗的玻璃化率有明顯的提高，這與趙佐敏[9]對(duì)非洲菊和王小敏[10]等對(duì)薄荷的研究結(jié)果相一致。綜合考慮增殖系數(shù)的因素，6-BA濃度應(yīng)以0.5 mg/L為宜，在此條件下，香石竹的增殖系數(shù)最高，玻璃化苗率較低。

瓊脂在培養(yǎng)基中不僅具有支撐組培苗平衡的作用，也影響培養(yǎng)基中可利用的水分[11]。瓊脂濃度較低時(shí)，培養(yǎng)基中可利用水分過(guò)多，不利于培養(yǎng)基中的滲透壓平衡，影響苗的生長(zhǎng)和分化，新生的幼苗呈水浸狀，導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重；瓊脂濃度過(guò)高，培養(yǎng)基內(nèi)可利用水分少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以被培養(yǎng)的組織吸收利用，芽分化力減弱，增殖系數(shù)較低[12]。結(jié)合成本等因素，在香石竹組織培養(yǎng)中，瓊脂的濃度可選擇8.0 g/L。

植物細(xì)胞脫分化、再分化及器官的形成受培養(yǎng)基滲透壓的影響，而蔗糖的濃度對(duì)培養(yǎng)基的滲透壓起決定性作用，適當(dāng)提高蔗糖的濃度，降低培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，從而降低玻璃化率，從本試驗(yàn)結(jié)果可知：培養(yǎng)基中附加蔗糖的濃度為30 g/L時(shí)，香石竹組培苗生長(zhǎng)最好。

活性炭具有吸附能力，在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭能減少一些有害物質(zhì)的影響[13-16]。相同激素濃度條件下，附加活性炭的培養(yǎng)基與未附加活性炭的培養(yǎng)基相比，其組培苗玻璃化率明顯降低，差異顯著。任東植[17]等研究表明，高濃度的6-BA對(duì)玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用，活性炭可以吸附培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，降低 6-BA的實(shí)際作用濃度，從而降低組培苗的玻璃化率。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，并考慮培養(yǎng)成本及培養(yǎng)周期等因素，確定以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、8.0 g/L瓊脂的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，香石竹組培苗的增殖系數(shù)正常，組培苗的玻璃化率較低。本試驗(yàn)中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA、瓊脂、蔗糖和活性炭等對(duì)克服香石竹玻璃化雖然表現(xiàn)出一定的規(guī)律，但試驗(yàn)中設(shè)置的各處理因子的濃度梯度及不同處理因子之間的互作影響還需要進(jìn)一步探究?jī)?yōu)化，以期能夠得出最佳的培養(yǎng)基組分，為生產(chǎn)上提供參考，同時(shí)為玻璃化現(xiàn)象的控制和苗質(zhì)的調(diào)控提供依據(jù)理論依據(jù)。

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