手足口病患兒IL—18對Th1/Th2平衡細胞因子IL—1、IL—8、IL—4、IL—10水平變化的影響

黃月艷等

【摘要】 目的 觀察手足口病（HFMD）患兒IL-18與Th1型細胞因子IL-1、IL-8及Th2型細胞因子IL-4、IL-10的水平變化，并探討手足口病發(fā)病的分子機制。

方法 選取2011年10月～2014年3月收治住院并診斷為HFMD患兒46例作為病例組，其中普通病例40例（普通病例組），重癥病例6例（重癥病例組）， 選取同期經(jīng)過健康體檢中心體檢的健康幼兒40例作為對照組，采用形態(tài)觀察、ELISA法檢測各細胞因子水平、淋巴細胞凝膠電泳觀察手段進行研究。

結(jié)果 與對照組比較，病例組表皮層增厚，血管增生、擴張，伴有炎癥細胞浸潤、表皮細胞碎片。與對照組比較，普通病例組和重癥病例組的IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10水平均顯著升高（P<0.01）。通過淋巴細胞凝膠電泳觀察到，病例組彗星細胞比對照組多。

結(jié)論 IL-18可能通過影響Th1型、Th2型細胞因子水平對Th1/Th2平衡進行調(diào)控而參與手足口病發(fā)病機制，IL-18有可能作為臨床干預(yù)手足口病的潛在靶點。

【關(guān)鍵詞】 白細胞介素18；手足口病；細胞因子

【Abstract】 Objective To observe the changes of levels of IL-18，Th1 cytokines （IL-1 and IL-8） and Th2 cytokines（IL-4 and IL-10） of children with hand-foot-mouth disease（HFMD），and to investigate the molecular mechanism of HFMD.

Methods 46 children who were admitted to hospital and diagnosed with HFMD were collected as case group，among which 40 normal cases were selected as normal case group，and 6 severe cases were selected as severe case group.And 40 healthy children proved by physical examination in physical examination center in the same period were selected as control group.Then，morphologic changes of skin lesion was observed，levels of cytokines was tested by ELISA，damage of lymphocyte was observed by gel electrophoresis.

Results Compared with the control group，epidermis of the cases group thickened，blood vessels proliferated and expanded，associating with inflammatory cell infiltration and epidermal cells fragments.Levels of IL-18， IL-1， IL-8，IL-4 and IL-10 of both normal case group and severe case group significantly increased comparing with those of the control group（P<0.01）.Observation of lymphocytes gel electrophoresis showed that the case group had more comet cells than the control group.

Conclusion IL-18 might regulate Th1/Th2 balance by affecting the levels of cytokine of type Th1 and Th2，which might be the part of the molecular mechanism of HFMD，and IL-18 is expected to become the potential molecule in the targeted therapy of HFMD.

【Key words】 interleukin-18；hand-foot-mouth disease；cytokines

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是一種兒科常見的傳染病，由多種腸道病毒引起，以 5 歲以下兒童發(fā)病為主[1]，其感染所致疾病多以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征?？滤_奇病毒A16型（coxsackievirusA16，CoxAl6）和腸道病毒7l型（enterovirus71，EV71）是引起HFMD的最常見病原[2]，HFMD確切的發(fā)病機制仍不清楚，病毒感染后可致機體細胞免疫功能紊亂，體液免疫功能受損等諸多病理改變[3]。白細胞介素18（Interleukin-18，IL-18）主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，能促進多種免疫細胞的增殖和分化，從而明顯提高機體的免疫功能，增強機體抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥能力[4]，被認為是靶向調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的重要因子。本研究通過檢測HFMD患兒IL-18表達、Th1型細胞因子IL-1、IL-8以及Th2型細胞因子IL-4、IL-10的水平變化，從IL-18調(diào)控細胞免疫、體液免疫和炎癥反應(yīng)角度探討HFMD的可能病理機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2011年10月～2014年3月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科收治住院并診斷為HFMD患兒46例作為病例組，其中男30例，女16例；普通病例40例（普通病例組），重癥病例6例（重癥病例組）；年齡6個月～7歲，平均（2.21±0.56）歲。選取同期經(jīng)過健康體檢中心體檢的健康幼兒40例作為對照組，無過敏性疾病及其他慢性病史， 排除其他腸道病毒性疾病或先天性免疫缺陷等疾病，近期均無呼吸道、消化道等感染病史。其中男26例，女14例，年齡8個月～6歲，平均（2.11±0.48）歲。病例組和對照組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究取得HFMD患兒監(jiān)護人知情同意并獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 病例入選和排除標準

依據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的《醫(yī)療機構(gòu)手足口病診療技術(shù)指南》（2011年版）診斷標準。普通病例：以發(fā)熱及手、足、口、臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹為主要表現(xiàn)。重癥病例：⑴重型：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)：包括精神差、嗜睡、易驚、譫妄；頭痛、嘔吐；肢體抖動、肌陣攣、眼球震顫、共濟失調(diào)、眼球運動障礙；無力或急性遲緩性麻痹；驚厥。體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失。⑵危重型：出現(xiàn)下列情況之一者：①頻繁抽搐、昏迷、腦疝。②呼吸困難、發(fā)紺、血性泡沫痰、肺部啰音等。③休克等循環(huán)功能不全表現(xiàn)。排除標準：其他腸道病毒性疾??；治療前4周使用過糖皮質(zhì)激素和免疫調(diào)節(jié)劑等藥物。

1.3 方法

1.3.1 皮損組織觀察

分別取患兒斑丘疹或皰疹結(jié)痂組織、健康者包皮環(huán)切術(shù)后皮膚組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，60℃的烤箱中烘烤30 min，再用二甲苯、無水酒精以及95%酒精、80%酒精、70%酒精、三蒸水脫蠟及脫水，蘇木素-伊紅溶液（HE）染色，樹膠固定封片，顯微鏡觀片拍攝。

1.3.2 IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10的檢測方法

無菌非抗凝管采集新鮮外周血2 ml，室溫靜置0.5 h后3000 r/min離心10 min吸取血清，每管50 μl分裝于EP管中，置-80℃冰箱保存待檢。ELISA法檢測IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10水平，IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10檢測試劑盒購自北京生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.3.3 淋巴細胞凝膠電泳觀察

在冰凍玻片上鋪正常溶點瓊脂糖，在室溫下靜置5 min，作為底層凝膠，0.6 μl淋巴細胞懸液與50 μl低熔點瓊脂充分混勻，鋪在底層凝膠上，加蓋玻片，靜置待膠凝固后取下蓋玻片，作為第2層凝膠，另外再加100 μl低熔點瓊脂鋪在第2層凝膠上作為第1層凝膠，在水平電泳槽內(nèi)電泳1 h。染色，封片，紅光激發(fā)，熒光顯微鏡觀片拍攝。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，3個樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗（Newman-Keuls法），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 皮損組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組皮膚表皮層細胞形態(tài)正常，排列層次分明，血管分布排列整齊。與對照組比較，病例組表皮層增厚，血管增生、擴張，伴有炎癥細胞浸潤、表皮細胞碎片。見圖1 。

2.2 IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10檢測結(jié)果

與對照組比較，普通病例組和重癥病例組的IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10水平均顯著升高（P<0.01）。見表2。

2.3 淋巴細胞凝膠電泳結(jié)果

正常淋巴細胞核在原位形成一個發(fā)亮的頭部，沒有移動，病例組中受損的淋巴細胞DNA由于受到破壞、碎裂，碎片攜帶負電荷向正極移動，碎片形成尾部，形狀像個彗星，即彗星細胞，彗星細胞數(shù)目可以反映細胞DNA受損程度。見圖2 。

3 討 論

Ushio等[5]發(fā)現(xiàn)一種多肽具有多種生物學(xué)功能，包括促進T細胞增殖，增強天然殺傷細胞活性等，根據(jù)其蛋白質(zhì)序列將其命名為白細胞介素18（Interleukin-18，IL-18）。IL-18可誘導(dǎo)Th1細胞、B細胞、NK細胞產(chǎn)生IFN-γ[6]，還可誘導(dǎo)IL-1、TNF-α、IL-8的分泌[7]，并能促進多種免疫細胞的增殖和分化，從而明顯提高機體的免疫功能，增強機體抗腫瘤、抗病毒、抗細菌能力[8]。IL-18也可誘導(dǎo)Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等釋放[9]，促進Th1應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，因而被認為是靶向調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的重要因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，病例組表皮層增厚，血管增生、擴張，伴有炎癥細胞浸潤、表皮細胞碎片；與對照組比較，普通病例組和重癥病例組的IL-18、IL-1、IL-8、IL-4、IL-10水平均顯著升高（P<001）。提示病毒感染后，機體啟動防御機制，表現(xiàn)為IL-18水平升高，繼而誘導(dǎo)IL-1、IL-8、IL-4、IL-10細胞因子的分泌和釋放，在各種細胞因子的綜合作用下，提高抗病毒、抗炎癥能力。因此，推測IL-18可能在HFMD病毒感染后抗病毒及免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵的作用，而且這種作用可能是通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡而發(fā)揮的。通過淋巴細胞凝膠電泳觀察到，病例組彗星細胞比對照組多，表明病毒感染后，機體的淋巴細胞遭到損傷，推測損傷的原因可能與IL-18的過度表達有關(guān)。通常情況下，HFMD病毒感染后，IL-18只是處于適度表達的狀態(tài)，這樣有利于機體抗感染免疫，但在病毒感染程度嚴重的前提下，IL-18有可能處于過度表達狀態(tài)，研究[10]已表明IL-18表達過度會誘發(fā)一系列病理生理改變，包括膿毒癥、急性器官功能損傷及某些自身免疫性疾病等，在膿毒癥早期發(fā)生促炎反應(yīng)后機體會迅速釋放大量的抗炎介質(zhì)如IL-4、IL-10等產(chǎn)生強烈的抗炎反應(yīng)，由此有可能損傷機體淋巴細胞。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，病例組的淋巴細胞受損程度較嚴重，和上述文獻的報道一致。提示在臨床治療上通過恰當(dāng)調(diào)節(jié)IL-18水平有可能既達到提高機體抗病毒、抗炎癥能力又可以避免IL-18過度表達帶來的對淋巴細胞的損害等不良作用，但如何界定IL-18過度表達仍然需要進一步的實驗。

參 考 文 獻

[1] 陳 鵬，陶澤新，王海巖，等. 新型人類腸道病毒的研究進展[J].病毒學(xué)報，2013，29（2）：211-217.

[2] Li W，Yi L，Su J，et al.Seroepidemiology of human enterovirus71 and coxsackievirusA16 among children in Guangdong province，China[J].BMC Infect Dis，2013，13：322.

[3] 王躍飛，鄭 瑞，陳葆國，等.手足口病相關(guān)免疫學(xué)指標檢測的病例對照研究[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，22（10）：15-17，21.

[4] Lin X，Huang R，Zhang S，et al.Methyl helicterate protects against CCl4-induced liver injury in rats by inhibiting oxidative stress，NF-κB activation，F(xiàn)as/FasL pathway and cytochrome P4502E1 level[J].Food Chem Toxicol，2012，50（10）：3413-3420.

[5] Ushio S，Namba M，Okura T，et al.Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor，expression in Escherichia coli，and studies on the biologic activities of the protein[J].J Immunol，1996，156（11）：4274-4279.

[6] Verardi PH，Legrand FA，Chan KS，et al.IL-18 expression results in a recombinant vaccinia virus that is highly attenuated and immunogenic[J].J Interferon Cytokine Res，2014，34（3）：169-178.

[7] Tang HP，Sun LX，Han W.Endothelial cells on the proliferation and expression of intercellular adhesion molecule 1 and interleukin 8 of vascular smooth muscle cells[J].Genet Mol Res，2013，12（4）：4363-4370.

[8] 潘興壽，藍景生，李天資，等.大蒜素治療病毒性心肌炎療效分析[J].右江醫(yī)學(xué)，2010，38（2）：120-122.

[9] Szymanowski K，Niepsuj-Binias J，Dera-Szymanowska A，et al.An influence of immunomodulation on Th1 and Th2 immune response in endometriosis in an animal model[J]. Biomed Res Int，2013，2013：849492.

[10] Novick D，Kim S，Kaplanski G，et al.Interleukin-18，more than a Th1 cytokine[J].Semin Immunol，2013，25（6）：439-448.

（收稿日期：2015-02-10 修回日期：2015-04-14）

（編輯：梁明佩）