程 濤，權(quán) 卓，楊麗霞，田廣芳，張定華，劉銅華

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2中國解放軍第十醫(yī)院；3甘肅省中醫(yī)院；4北京中醫(yī)藥大學

新加糖腎康對高糖環(huán)境下HK-2細胞TGF-β/Smads信號通路的影響*

程 濤1，權(quán) 卓2，楊麗霞1，田廣芳3，張定華3，劉銅華4

1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2中國解放軍第十醫(yī)院；3甘肅省中醫(yī)院；4北京中醫(yī)藥大學

目的：通過觀察新加糖腎康（TSK）對高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞（H K-2）TG F-β/Sm ads信號通路的影響，探討其防治糖尿病腎病的作用機制。方法：體外培養(yǎng)H K-2細胞，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，實驗分為6組：空白對照組、高糖組（30 m m ol/LD-葡萄糖）、空白血清對照組（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%空白血清）、新加糖腎康低劑量組（30 m m ol/L D-葡萄糖+5%TSK藥物血清）、新加糖腎康中劑量組（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%TSK藥物血清）、新加糖腎康高劑量組（30 m m ol/LD-葡萄糖+20%TSK藥物血清）。ELISA法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TG F-β1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體I（TG F-βRⅠ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ（TG F-βRⅡ）、Sm ad2、Sm ad3的表達。結(jié)果：H K-2細胞經(jīng)高糖環(huán)境培養(yǎng)后TG F-β1、TG F-βRⅠ、TG F-β RⅡ、Sm ad2、Sm ad3的含量顯著增加，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但經(jīng)新加TSK干預后其含量下降，與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：中藥復方TSK能夠抑制腎小管上皮細胞TG F-β/Sm ads信號通路，具有防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的作用。

新加糖腎康；高糖；人腎小管上皮細胞；TG F-β/Sm ads通路

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害大，在糖尿病所有并發(fā)癥中占主要地位，直接關(guān)系著糖尿病患者的生活質(zhì)量。截至目前，國內(nèi)外進行了大量DN的研究，但對其發(fā)病機制尚未完全解釋清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)纖維化與DN密切相關(guān)［1］。因此，通過干預腎間質(zhì)纖維化預防DN的研究逐漸興起，特別是有關(guān)中醫(yī)藥的研究越來越多。

中藥復方新加糖腎康是在甘肅省中醫(yī)院劉國安和張定華主任醫(yī)師研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合北京中醫(yī)藥大學劉銅華教授治療DN的學術(shù)思想［2-3］，經(jīng)過組方優(yōu)化，最終確立的臨床經(jīng)驗方，全方具有“益氣養(yǎng)陰，清熱祛濕，活血化瘀”的功效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖腎康對2型糖尿病患者血液流變學指標具有一定的改善作用，并能減少尿微量白蛋白，對DN患者具有較好的臨床療效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新加糖腎康能夠減少高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞的細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(ColⅢ)和纖連蛋白(FN)的分泌與沉積，并能調(diào)控纖維化因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)及其抑制劑-1(TIMP-1)的分泌與釋放［4-5］。本課題在此研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察其對高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路的影響，進一步揭示其治療DN的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞株 SPF級雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，購于甘肅中醫(yī)學院動物中心，許可證號：SCXK(甘)2011-0001，飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動物室。人腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司，培養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥研究院中心實驗室細胞培養(yǎng)室中。

1.2 藥品與試劑 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：1237579)；胎牛血清(Gibco公司，批號：12657-029)。人TGF-β1ELISA試劑盒(批號：E9372Hu)；TGF-β RⅠELISA試劑盒 (批號：E3571Hu)；TGF-β RⅡELISA試劑盒(批號：E3572Hu)；Smad2 ELISA試劑盒(批號：E2911Hu)；Smad3 ELISA試劑盒(批號：E2912Hu)，生產(chǎn)廠家均為上海晶天生物科技有限公司。D-葡萄糖(汕頭西隴化工廠有限公司，批號：0810142)，用時配成30 mmol/L的濃度［6］。新加糖腎康所用中藥材購于甘肅省中醫(yī)院藥劑科，主要組成有黃芪、生地黃等藥材，用時水提醇沉，冷藏備用。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：MCO-18AIC，廠家：SANYO，日本)；超凈生物安全柜(型號：SW-CJ-2FD，廠家：蘇凈安泰，中國)；倒置顯微鏡(型號：IX51，廠家：Olympus，日本)；酶標儀(型號：MS 352，廠家：Labsystems，芬蘭)；-80℃超低溫冰箱(型號：MDF-U53V，廠家：SANYO，日本)；立式滅菌器(型號：LMQ.CV，廠家：山東新華，中國)。

1.4 方法

1.4.1 新加TSK藥物血清制備方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為：空白組和藥物組，每組10只。藥物組采用新加TSK灌胃，劑量為成人臨床用量的6.5倍；空白組采用同體積生理鹽水灌胃。每次灌胃體積為0.01 mL/g(體質(zhì)量)。早、晚各1次，持續(xù)3天。最后1次灌胃前禁食，不禁水，在灌胃30分鐘后，大鼠股動脈無菌采血，冷凍離心吸取血清，裝入EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 H K-2細胞培養(yǎng)及實驗分組 HK-2細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞生長融合達到80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化，顯微鏡下觀察細胞消化程度，及時拍落消化的細胞，用完全培養(yǎng)基終止消化，低速離心5分鐘，用新鮮培養(yǎng)基將細胞吹打均勻后進行傳代培養(yǎng)。實驗分為6組，空白對照組：1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖組：在1640培養(yǎng)液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，對細胞進行高糖環(huán)境下培養(yǎng)；空白血清對照組：在高糖組的基礎(chǔ)上，加入10%空白血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)；新加糖腎康低、中、高劑量組：在高糖組的基礎(chǔ)上，分別加入5%、10%、20%新加TSK藥物血清，對細胞進行干預性培養(yǎng)。

1.4.3 指標檢測 采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量。

1.4.3.1 樣本制備 將傳代培養(yǎng)的細胞吹打均勻，接種在24孔細胞培養(yǎng)板中，劑量為1 mL，每組3孔，接種2板。2小時后在顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態(tài)。培養(yǎng)24小時后吸棄上清。每組加入1 mL含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48小時，仔細吸取每孔細胞上清于1.5 mL的EP管中，4℃離心，取上清，低溫保存待測。

1.4.3.2 指標檢測方法 按照ELISA試劑盒說明書進行。檢測前將樣本置室溫慢慢融化，在反應條孔中加入標準品或待測標本，每孔劑量為100μL。在空白對照孔加入100 μL稀釋液。在37℃培養(yǎng)箱中孵育，孵育后洗滌反應板，最后加酶標抗體進行酶聯(lián)免疫反應。反應終止后，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀450 nm處測定各孔OD值。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，計量資料以(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組HK-2細胞經(jīng)ELISA檢測后顯示：正常培養(yǎng)的HK-2細胞經(jīng)高糖培養(yǎng)24、48小時后，TGF-β/ Smads信號通路上的蛋白分子TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量顯著增加，高糖培養(yǎng)48小時時，各蛋白分子的含量更多，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但在新加TSK干預性培養(yǎng)后，其含量開始減少，并且隨著藥物劑量的增加及作用時間的延長，藥效逐漸加強，特別是在藥物高劑量、作用48小時時，效果更為明顯，與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而空白血清對照組則無此作用。結(jié)果表明，新加TSK能夠抑制高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路，在一定程度上抑制了糖尿病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展，見表1—5。

表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 29.344±8.770 30.866±2.616高糖組 3 94.144±5.001*111.921±2.377*空白血清對照組 3 29.942±3.218△28.093±4.625△新加糖腎康低劑量組 3 90.502±7.529*76.041±1.876*△新加糖腎康中劑量組 3 88.056±11.137*77.564±1.876*△新加糖腎康高劑量組 3 83.652±8.781*72.671±7.195*△

表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 442.954±72.263 485.661±17.491高糖組 3 848.671±101.098*1070.881±21.592*空白血清對照組 3 436.948±70.066△404.918±50.526△新加糖腎康低劑量組 3 755.916±58.342*707.204±50.048*△新加糖腎康中劑量組 3 683.848±79.506*695.192±46.174*△新加糖腎康高劑量組 3 609.111±69.722△497.005±86.268△

表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 402.842±49.284 367.093±28.694高糖組 3 712.308±25.727*845.698±61.127*空白血清對照組 3 344.684±46.457△370.828±70.212△新加糖腎康低劑量組 3 625.870±19.297*558.642±31.786*△新加糖腎康中劑量組 3 620.535±95.894*546.370±51.181*△新加糖腎康高劑量組 3 480.208±25.926△417.248±52.188*△

表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 273.212±17.254 370.347±49.673高糖組 3 657.410±13.259*841.368±56.214*空白血清對照組 3 332.361±65.145△344.300±49.163△新加糖腎康低劑量組 3 619.424±50.151*586.322±52.860*△新加糖腎康中劑量組 3 554.306±60.014*558.647±75.666*△新加糖腎康高劑量組 3 458.256±27.192*△373.603±46.589△

表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 24 h 48 h空白對照組 3 277.418±19.498 350.608±39.562高糖組 3 692.518±57.764*837.829±35.706*空白血清對照組 3 371.443±55.527△316.417±92.657△新加糖腎康低劑量組 3 564.836±86.995*570.712±74.538*△新加糖腎康中劑量組 3 534.919±46.955*517.823±23.610*△新加糖腎康高劑量組 3 425.401±29.085△406.169±30.296△

3 討論

近年研究認為，糖尿病腎病(DN)的形成與發(fā)展與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是所有腎臟疾病發(fā)展進行到終末期的共同病理改變的基礎(chǔ)。其形成與多種病理因素相關(guān)，最為常見的有高血壓、高血糖、蛋白尿、氧化應激及各類纖維化因子等。這些病理因素通過特定的信號通路引起腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，致使上皮細胞的形態(tài)發(fā)生改變，成為另一種新的細胞。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化后，主要變?yōu)榧〕衫w維細胞，這是細胞外基質(zhì)成分的主要來源，也是纖維化形成的主要特征［7］。因此，干預腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化、抑制腎間質(zhì)纖維化成為防治DN的主要途徑。

腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程中起關(guān)鍵作用的是TGF-β，已被公認為纖維化最主要的誘導因子，且其他細胞因子均通過調(diào)節(jié)TGF-β的表達來發(fā)揮作用。Yang等［8］研究報道，在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中，TGF-β1參與了纖維化的發(fā)展過程，誘導了腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。Fan等［9］報道，在鼠腎小管上皮轉(zhuǎn)分化中，纖維化程度隨著TGF-β劑量的增加而增強。TGF-β誘導纖維化的作用主要通過Smads信號通路來實現(xiàn)［10］，止消通脈寧和糖耐康干預糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化也證實了這一觀點［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下人腎小管上皮細胞TGF-β1的含量顯著增加，其受體TGF-β RI、TGF-β RII的含量以及下游信號分子Smad2、Smad3的含量均顯著增強，與既往報道基本一致，說明Smads信號通路激活是糖尿病腎間質(zhì)纖維化的機制之一。因此，抑制TGF-β/Smads信號通路是干預腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵。

目前關(guān)于腎間質(zhì)纖維化的治療缺乏有效措施，許多研究仍處在初級階段，西醫(yī)研究主要集中在TGF-β中和抗體或天然拮抗劑及基因治療等方面，這些研究成本高，期限長，缺乏臨床實踐基礎(chǔ)，藥物應用前景難以預測。近年來，中醫(yī)藥在該方面的研究越來越多，從化濁排毒、清熱利濕、活血化瘀等多個角度開展了很多抗纖維化的基礎(chǔ)研究及臨床研究，涉及臨床觀察、動物實驗、細胞實驗，并取得了較好的研究效果［13］。

DN屬中醫(yī)“消渴”兼“腎病”范疇。古代醫(yī)家認為：消渴日久，臟腑氣血虛衰，水濕痰濁內(nèi)停，瘀血阻絡(luò)，發(fā)為水腫尿甜?；静C特點為“本虛標實”。本課題所選中藥復方新加糖腎康，由生黃芪、地黃等中藥組成，方中黃芪、生地黃益氣養(yǎng)陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。其中水蛭為新增蟲類藥，加強了組方的活血化瘀作用。全方具有“益氣養(yǎng)陰，清熱祛濕，活血化瘀”的功效，符合DN“本虛標實”的理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，新加糖腎康能夠抑制高糖環(huán)境培養(yǎng)下人腎小管上皮細胞TGF-β1超表達，進而抑制了TGF-β RI、TGF-β RII的表達，繼而抑制了其信號通路分子Smad2、Smad3的表達，最終抑制了腎間質(zhì)纖維化的信號轉(zhuǎn)導，阻止了纖維化的發(fā)展，這可能是其防治糖尿病腎間質(zhì)纖維化的分子機制之一。

［1］ 李能娟，李紅.腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化與糖尿病腎?。跩］.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2006，26(4)：277-279．

［2］ 張東鵬，張定華，王曉暉.糖腎康膠囊對早期糖尿病腎病患者血漿內(nèi)皮素-1、尿微量白蛋白的影響［J］.中華實用中西醫(yī)雜志，2010，24（2）：42-44．

［3］ 楊麗霞.劉銅華教授中醫(yī)診治糖尿病腎病的學術(shù)思想［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2008，30（5）：385-386.

［4］ 朱苗蕊，楊麗霞，薛建軍，等.新加糖腎康對高糖環(huán)境下H K-2細胞外基質(zhì)成分沉積的作用研究［J］.中醫(yī)研究，2015，28（3）：56-58.

［5］ 柴青春，楊麗霞，薛建軍，等.糖腎康對高糖誘導人腎小管上皮細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制劑-1的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（10）：58-60.

［6］ 凌光輝，唐文彬，孫林，等.Sm ad錨著蛋白在高糖誘導人腎小管上皮細胞細胞外基質(zhì)沉積中的作用［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2012，21（4）:346-352.

［7］ 劉海軍，劉麗秋，于俊生.腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制及其中藥防治進展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2005，6（11）: 677-680.

［8］ Y ang J，Li u Y.D i ssect i on ofkey event s i n t ubul ar epi t hel i al t o m yofi brobl ast t ransi t i on and i t s i mpl i cat i ons i n renali nt erst i t i alfi brosi s［J］.A m J of pat hol，2001，159(4):1465-1475.

［9］ Fan JM，N g Y Y，H i l l PA，et al.Transfor m i ng grow t h fact orbet a regul at es t ubul ar epi t hel i al-m yofi brobl ast t ransdi fferent i at i on i n vi t ro［J］.K i dney Int，1999，56(4):1455-1467.

［10］楊麗霞，劉銅華，黃宗濤，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導人腎小管上皮細胞增殖的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2010，11（10）：912-913.

［11］楊麗霞，舒暢，吳麗麗，等.糖耐康對TG F-β1誘導的H K-2細胞Sm ads信號通路的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（20）：160-163.

［12］楊麗霞，李曉東，程濤，等.止消通脈寧干預轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導人腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（1）：37-39.

［13］楊麗霞，黃宗濤，劉銅華，等.中藥復方防治腎纖維化的實驗研究概況［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（9）：211-213.

Influence of XinJia TangShenKang on TGF-β/Smads Signal Channel of HK-2 Cells in High Concentrations of Glucose

CHENG Tao1,QUAN Zhuo2,YANG Lixia1,TIAN Guangfang3,ZHANG Dinghua3,LIU Tonghua4
1 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 The Tenth Hospital of Chinese PLA;
3 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine;4 Beijing University of Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of XinJia TangShenKang (TSK)in treating diabetic nephropathy by observing its effects on TGF-β/Smads signal channel of human renal tubular epithelial cells HK-2 in high concentrations of glucose.Methods:HK-2 cells were cultivated in 1640 culture media containing 10%fetal bovine serum,they were randomized into six groups:blank control group,high glucose group (30 mmol/L D-glucose),the control group of blank serum (30 mmol/L D-glucose+10%blank serum),low dose (30 mmol/L D-glucose+5%TSK medicated serum),moderate dose(30 mmol/L D-glucose+10%TSK medicated serum)and high dose(30 mmol/L D-glucose+20%TSK medicated serum)groups of TSK.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1,TGF-β RⅠ,TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3.Results:The contents of TGF-β1,TGF-β RⅠ, TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3 increased significantly after HK-2 cells cultivated in high concentrations of glucose, it had significant difference compared with blank control group(P＜0.05).The contents of these indexes decreased after intervened with XinJia TSK,and it had significant difference compared with high glucose group(P＜0.05). Conclusion:The compound TSK could inhibit TGF-β/Smads signal channel of HK-2,it could prevent and treat diabetic renal interstitial fibrosis.

XinJia TangShenKang;highglucose;humanrenaltubularepithelialcells;TGF-β/Smadssignalchannel

R587.1

A

1004-6852(2015)11-0013-04

2015-05-07

甘肅省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術(shù)研究課題（編號G ZK-2011-13）。

程濤(1971—)，男，副主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學。