張慶彬 程 成

(浙江工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用物理系，杭州310023)

基于NaYF4∶Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的復(fù)合微球組裝及其光動(dòng)力活性

張慶彬＊程 成

(浙江工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用物理系，杭州310023)

采用微乳液法，以NaYF4∶Yb3+，Er3+納米晶為發(fā)光基元，肽菁鋅(ZnPc)光敏分子與十八碳烯-馬來酸酐共聚物(PMAO)為功能分子，一步組裝獲得了NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球，此微球同時(shí)具備成像與光動(dòng)力活性功能，NaYF4可作為低生物背景的熒光成像劑，同時(shí)其上轉(zhuǎn)換發(fā)光可以敏化ZnPc用于光動(dòng)力活性研究，PMAO分子經(jīng)過簡單的水解反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)表面羧基功能化。TEM，Zeta電位與PL測試證實(shí)了微球的結(jié)構(gòu)與性能。利用熒光共聚焦成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對Hela細(xì)胞的發(fā)光成像；進(jìn)一步通過單線態(tài)氧監(jiān)測及980 nm光照下的MTT法細(xì)胞活性測試表明微球具有光動(dòng)力活性功能。

NaYF4∶Yb3+，Er3+；上轉(zhuǎn)換發(fā)光；復(fù)合微球；生物成像；光動(dòng)力治療

光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy，PDT)[1]是指光敏劑選擇性的聚集在腫瘤組織中，接受光照后在區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)，1O2能夠造成細(xì)胞膜的不可逆損傷，從而使腫瘤細(xì)胞凋亡的一種治療方法。相對于手術(shù)等治療方法因其具有靶向性、低損傷的優(yōu)點(diǎn)而在腫瘤治療領(lǐng)域備受關(guān)注[1-4]。在光動(dòng)力治療中光敏劑通常有兩個(gè)作用，首先是利用其光敏活性在光照下產(chǎn)生活性氧進(jìn)行PDT治療，同時(shí)利用其自身熒光探測病變所在區(qū)域[5-7]。然而，大部分光敏劑的激發(fā)光源為短波長的紫外或可見光，短波長光組織穿透能力弱，同時(shí)會(huì)激發(fā)生物體的背景熒光降低檢測的信噪比以及光敏化效果；此外，光敏分子自身也存在易于被藍(lán)紫光漂白的不足。針對這些問題，有工作提出將半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)與光敏劑相結(jié)合，利用QDs發(fā)光敏化光敏分子，同時(shí)QDs高的發(fā)光穩(wěn)定性可以提高檢測的準(zhǔn)確性，但由于QDs下轉(zhuǎn)換的發(fā)光機(jī)制同樣面臨短波長激發(fā)光組織穿透能力弱，敏化效果不佳的缺陷[8]。

稀土離子摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究引起了人們的廣泛關(guān)注[9-11]。上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制是一種非線性光學(xué)過程，即長波長的光照射物體經(jīng)過多光子吸收或能量傳遞等過程，產(chǎn)生短波長的發(fā)射光。因此，上轉(zhuǎn)換納米晶具有稀土發(fā)光材料狹窄發(fā)射譜帶、寬Stokes頻移、更高發(fā)光穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，特別是其近紅外光(980 nm)激發(fā)的上轉(zhuǎn)換的發(fā)光特性，在生物檢測中具有深的組織穿透能力，極低的生物背景熒光等優(yōu)點(diǎn)，使其已經(jīng)被廣泛用于生物領(lǐng)域的成像、檢測及治療研究[9-12]。目前，已經(jīng)有一些工作報(bào)道基于UCNPs的PDT研究[13-20]。其基本原理是980 nm光源激發(fā)上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)光，再通過納米晶與光敏分子間的能量傳遞過程激發(fā)光敏分子從而敏化環(huán)境中的分子氧而產(chǎn)生1O2，目前PDT材料構(gòu)建的策略主要是在納米粒子的表面包覆層(如SiO2)內(nèi)裝填光敏分子[13-17]，或者利用親水性分子或聚合物對粒子進(jìn)行表面親水性修飾，利用表面親水基團(tuán)(如：-COOH，-NH2)偶聯(lián)光敏分子的方法[20]。這些材料制備方法都需要經(jīng)過復(fù)雜的表面修飾過程，比如在表面附加包覆層內(nèi)填裝的方法，顆粒表面包覆層的厚度難于精確控制，材料的可重復(fù)性受到一定的限制；同時(shí)，由于受到包覆層厚度和偶聯(lián)劑鏈長的限制而增加了上轉(zhuǎn)換納米晶(給體)與光敏分子(受體)間的距離，降低了能量傳遞的效果；因此，有必要發(fā)展新的光敏粒子組裝策略簡化材料的制備過程，提高光敏化效率。

本文以油相UCNPs為發(fā)光基元，加入與納米晶表面相容的肽菁鋅(ZnPc)作為光敏藥物，與十八碳烯-馬來酸酐交替共聚物(PMAO)共同組裝，一步獲得了UCNPs-ZnPc-PMAO復(fù)合微球，該微球同時(shí)具備成像與光敏活性功能，經(jīng)簡單的水解反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)羧基功能化。TEM，PL，Zeta電位等測試證實(shí)了復(fù)合體的光學(xué)性能與表面性質(zhì)，采用熒光共聚焦成像技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對Hela細(xì)胞的光學(xué)成像，進(jìn)一步通過單線態(tài)氧測試以及980 nm光照下的MTT法細(xì)胞活性測試表明材料具有優(yōu)良的光動(dòng)力活性功能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

合成納米晶所用稀土氯化物為自制，稀土氧化物Y2O3(99.99%)，Yb2O3(99.99%)，Er2O3(99.99%)均購買于北京稀土創(chuàng)新技術(shù)有限公司，濃鹽酸(HCl)；NH4F(98%)，油酸(OA)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，9，10-二亞甲基丙二酸蒽均購買于中國化學(xué)試劑公司。十八碳烯(ODE；90%，Alfa aesar)，聚馬來酸酐與十八碳烯的交替共聚物(PMAO；Mr=30 000～50 000，Aldrich)。磷酸鹽緩沖液(PBS，0.05 mol·L-1，pH=7.4)以及NaAc-HAc緩沖液(0.01 mol·L-1，pH=5.0)等自己配制。生物試劑包括DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，血清等購自蘇州科晴生物技術(shù)公司。

微球的尺寸和形貌通過G2 F20 S-Twin FEI型場發(fā)射透射電子顯微鏡測試，加速電壓為200 kV；上轉(zhuǎn)換發(fā)光是在Hitachi F4600熒光光譜儀外接980 nm激光器光源測得(激發(fā)光功率為1 mW)；表面電性采用Colloidal Dynamics Zeta電位分析儀測試得到。微球細(xì)胞成像為Leica TCS SP5共聚焦顯微成像系統(tǒng)測試；細(xì)胞活性數(shù)據(jù)采用Perkin ElmerVictor多功能酶標(biāo)儀測得。

1.2 上轉(zhuǎn)換納米晶NaYF4∶Yb3+，Er3+的合成

NaYF4∶Yb3+，Er3+合成參照報(bào)道的方法稍作修改[21]。首先按比例稱取YCl3(0.78 mmol)，YbCl3(0.2 mmol)，ErCl3(0.02 mmol)放入50 mL的三頸瓶中，加入9 mL油酸和12 mL的十八碳烯，體系加熱升溫到160℃溶解稀土鹽，冷卻至室溫，將NaOH(2.5 mmol)和NH4F(4 mmol)的甲醇溶液注入到反應(yīng)體系中，緩慢攪拌30 min。之后，在氬氣流保護(hù)下升溫逐漸蒸出甲醇等雜質(zhì)，升溫至300℃反應(yīng)1 h，結(jié)束反應(yīng)冷卻至常溫，離心收集產(chǎn)物，分別用乙醇與水的混合液，乙醇與二氯甲烷的混合液清洗2次，獲得納米晶分散于二氯甲烷中備用。

1.3 NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球組裝

NaYF4-ZnPc-PMAO通過微乳液組裝技術(shù)獲得，將包含4 mg NaYF4∶Yb3+，Er3+納米晶的二氯甲烷溶液與包含0.2 mg PMAO的二氯甲烷溶液混合，取0.1 mL肽菁鋅(ZnPc)的四氫呋喃飽和溶液加入體系，使有機(jī)相的總體積為1 mL。有機(jī)相與10 mL包含50 mg SDS的去離子水溶液混合，高速機(jī)械攪拌得到穩(wěn)定的微乳液，之后，加熱到40℃，在緩慢攪拌下逐漸蒸發(fā)掉體系內(nèi)的有機(jī)溶劑。加入NaOH溶液調(diào)體系的pH值為13，繼續(xù)緩慢攪拌溶液保持10 h，結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)離心清洗后分散于去離子水中備用。

1.4 復(fù)合微球的細(xì)胞成像

人癌細(xì)胞系的Hela細(xì)胞在培養(yǎng)箱5%CO2，37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。選擇對數(shù)期的細(xì)胞，按一定濃度種入超薄培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后將0.2 mg·mL-1濃度的NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球加入培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；之后將培養(yǎng)基吸干，用PBS緩沖液反復(fù)清洗掉游離的納米粒子，加入少量的培養(yǎng)液進(jìn)行共聚焦細(xì)胞成像檢測。

1.5 MTT法研究微球的細(xì)胞毒性與光動(dòng)力細(xì)胞殺傷能力

MTT測試細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)過程為：收集對數(shù)期的Hela細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)確定細(xì)胞濃度，培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為1×105mL-1，之后，種入96孔板(每孔100 μL)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼滿孔板底部，將不同濃度梯度的藥物加入培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；將96孔中的原培養(yǎng)液洗出，用pH 7.4 PBS清洗2次，加入新的培養(yǎng)基，每孔加入20 μL的MTT，用錫箔紙包覆好，放入培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h，之后將培養(yǎng)基吸干，每孔加入150 μL的DMSO,用移液槍輕吹溶液使結(jié)晶充分溶解，通過多孔板檢測儀進(jìn)行光譜測試。

細(xì)胞培養(yǎng)與種板方法與以上相同，接種5組細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，第一組作為參比樣品，第2～5組加入復(fù)合材料進(jìn)行光動(dòng)力活性研究。操作過程如下：待細(xì)胞貼壁后在治療組加入0.2 mg·mL-1的復(fù)合藥物，培養(yǎng)2～4 h，之后分別對2～5治療組進(jìn)行不同時(shí)間長度的980 nm光照射，在本實(shí)驗(yàn)中，第2～5組照射時(shí)間分別為5，10，15，20 min；將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后，吸出原培養(yǎng)基，經(jīng)PBS緩沖液清洗后加入含有MTT的新培養(yǎng)基，孵育2 h，再次移除培養(yǎng)基，加DMSO溶解晶體，通過多孔板檢測儀進(jìn)行光譜測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合微球的組裝與描述

上轉(zhuǎn)換光敏復(fù)合微球制備過程(圖1)中，首先將NaYF4∶Yb3+，Er3+納米晶與PMAO聚合物按一定質(zhì)量比均一的分散在二氯甲烷中，肽菁鋅(ZnPc)光敏分子先在少量四氫呋喃溶液中溶解，再與納米晶聚合物體系混合，這樣可以利用四氫呋喃的油水雙溶性增加ZnPc在二氯甲烷中的溶解度，使ZnPc與納米晶，PMAO共同組成微乳體系的油相。由于ZnPc是具有疏水性的分子，而NaYF4∶Yb3+，Er3+表面油酸配體以及PMAO聚合物都具有豐富的疏水碳鏈，因此，三者極易通過疏水相互作用結(jié)合，經(jīng)過乳化與低溫油相溶劑蒸發(fā)過程疏水部分逐漸結(jié)合就可以得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合微球，NaYF4∶Yb3+，Er3+納米晶及微球的電鏡展示在圖2中，電鏡結(jié)果顯示納米晶的平均粒徑為15 nm，復(fù)合微球尺寸分布在200～300 nm之間，在微球的電鏡圖中可以清晰的看到納米晶之間的間隙，這是粒子與聚合物及肽菁鋅共同組裝的特征形貌，粒子之間被有機(jī)層隔開，表明粒子與有機(jī)分子均一的組裝在一起，這樣就通過簡單的一步法微乳液組裝過程，成功實(shí)現(xiàn)了單一顆粒內(nèi)多種功能的復(fù)合。首先，微球內(nèi)的NaYF4∶Yb3+，Er3+納米晶具有良好的上轉(zhuǎn)換發(fā)光功能，自身可以作為低生物背景熒光的光學(xué)成像劑；其次，在微球中共同組裝的ZnPc分子可以被納米晶的紅光發(fā)射所敏化產(chǎn)生單線態(tài)氧，因而具有光動(dòng)力活性，這樣材料就具備了成像與光動(dòng)力治療的復(fù)合功能。圖2(c)展示了980 nm光源激發(fā)的上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜與ZnPc的吸收光譜的交疊情況，光譜中光敏分子ZnPc的吸收與納米晶的紅光發(fā)射(650 nm)部分有良好的重疊表明其適合通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光進(jìn)行敏化。

圖1 NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球組裝過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of the self-assembly process of NaYF4-ZnPc-PMAO composite microspheres

圖2 (a)NaYF4∶Yb3+,Er3+納米晶的TEM結(jié)果,(b)復(fù)合微球TEM結(jié)果,(c)上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜與ZnPc的吸收光譜Fig.2 (a)TEM image of NaYF4∶Yb3+,Er3+nanocrystals;(b)TEM image of the NaYF4-ZnPc-PMAO composite microspheres; (c)Fluorescence spectra of the NaYF4∶Yb3+,Er3+(black line)and absorption spectra of the ZnPc(dot line)

在這種復(fù)合微球設(shè)計(jì)中一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是不需要額外的水溶性修飾，組裝微球的聚合物分子中包含大量的酸酐基團(tuán)，酸酐經(jīng)簡單的水解處理就可以使微球表面含有豐富的羧基，這些羧基不僅使NaYF4-ZnPc-PMAO微球具有優(yōu)良的親水性，同時(shí)，也可以作為反應(yīng)基團(tuán)為后續(xù)的應(yīng)用偶聯(lián)功能分子。作為結(jié)果，微球可以均一的分散在水及PBS等緩沖溶液中，在水溶液中呈現(xiàn)ZnPc的藍(lán)色，用980 nm光源照射溶液可以觀測到上轉(zhuǎn)換發(fā)光(Supporting information 1)，與NaYF4納米晶相比微球的發(fā)射光譜中紅光譜帶(650 nm)有輕微的降低，表明有部分能量被ZnPc吸收(supporting information 2)。為了進(jìn)一步確定微球的表面性質(zhì)，對微球進(jìn)行了表面ζ電位測試，測試結(jié)果顯示微球表面電位為-38.7 mV (supporting information 3)，強(qiáng)的電負(fù)性表明粒子的表面為負(fù)電性的羧基功能團(tuán)。

2.2 NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球Hela細(xì)胞成像

上轉(zhuǎn)換納米晶的激發(fā)光源為980 nm的近紅外光，在檢測中不會(huì)激發(fā)生物體的自身熒光，因此，相對于藍(lán)紫或可見光激發(fā)的下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，成像清晰，具有更高的信噪比。為了表征復(fù)合微球的成像功能，我們選用人癌細(xì)胞系的Hela細(xì)胞與復(fù)合微球共同孵育，通過非特異性吸附過程進(jìn)行細(xì)胞成像測試，結(jié)果顯示了清晰的細(xì)胞形態(tài)，上轉(zhuǎn)換發(fā)光與細(xì)胞很好的符合(圖3)，表明制備的微球適合用于生物成像研究。

圖3 NaYF4-ZnPc-PMAO微球用于Hela細(xì)胞共聚焦熒光成像Fig.3 Confocal fluorescence images of the Hela cell

2.3 NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球的光動(dòng)力活性

為了驗(yàn)證復(fù)合微球的光動(dòng)力活性，我們選擇單線態(tài)氧檢測劑9，10-二亞甲基丙二酸蒽(ABDA)分子對單線態(tài)氧進(jìn)行了檢測，測試過程中將0.2 mg·mL-1微球與ABDA分子分散于PBS緩沖液中，以980 nm光進(jìn)行照射，分別在不同時(shí)間長度進(jìn)行ABDA的光譜檢測，測試結(jié)果顯示隨著照射時(shí)間的延長ABDA發(fā)射光譜明顯減弱，這是由于單線態(tài)氧(1O2)能夠猝滅ABDA發(fā)光所導(dǎo)致的，表明980 nm光照射下環(huán)境中不斷有1O2產(chǎn)生(圖4)，間接的證明復(fù)合微球通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光能夠敏化光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧。以此為基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步對微球的癌細(xì)胞光動(dòng)力殺傷性能進(jìn)行研究。在此之前我們選擇5組細(xì)胞分別加入不同濃度的復(fù)合微球，采用MTT法對復(fù)合微球的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評價(jià)(圖5a)，細(xì)胞增殖能力數(shù)據(jù)顯示復(fù)合微球本身對細(xì)胞生長有一定的抑制作用，隨著體系內(nèi)加入微球含量的遞增，對細(xì)胞增殖能力的影響逐漸增強(qiáng)，表明微球本身有一定的細(xì)胞毒性。我們選擇毒性相對較低的濃度0.2 mg·mL-1的微球進(jìn)行光動(dòng)力癌細(xì)胞殺傷效果的研究。將微球與Hela細(xì)胞共同孵育2～4 h后，第1組樣品不進(jìn)行光照射，第2～5組用980 nm光源分別照射5，10，15與20 min，在每組當(dāng)中另取未加入復(fù)合微球的Hela細(xì)胞進(jìn)行相同時(shí)長的980 nm光源照射作為對照。之后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT測試(圖5b)，結(jié)果顯示經(jīng)過980 nm光照射的樣品細(xì)胞增殖能力明顯變差，隨著照射時(shí)間的延長對細(xì)胞生長的抑制效果顯著增強(qiáng)，而未加入微球的對照組細(xì)胞增殖情況正常，表明材料具有光動(dòng)力活性功能，可用于潛在的生物醫(yī)學(xué)治療研究。

圖4980 nm光源不同時(shí)長照射微球?qū)?,10-二亞甲基丙二酸蒽發(fā)光的猝滅程度檢測單線態(tài)氧Fig.4 9,10-Anthracenedipropanoicacid luminescence quenching method for the determination of singlet oxygen under 980 nm laser

圖5 (a)MTT法微球的細(xì)胞毒性測試;(b)不同時(shí)間長度照射下微球?qū)?xì)胞增殖能力的影響(黑色柱體),淺灰色柱體為未加入微球的細(xì)胞樣品Fig.5 (a)MTT method cancer cell viability test;(b)Cancer cell activity test under different time irradiations under 980 nm laser,containing NaYF4-ZnPc-PMAO samples(black columns),without NaYF4-ZnPc-PMAO samples(gray column)

3 結(jié)論

本文采用微乳液技術(shù)制備了一種集成像與光敏活性功能于一體NaYF4-ZnPc-PMAO復(fù)合微球，此微球具有制備方法簡單，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，功能復(fù)合的特點(diǎn)。在微球內(nèi)聚集的NaYF4∶Yb3+，Er3+上轉(zhuǎn)換納米晶可作為低生物背景的熒光成像劑，與納米晶緊密結(jié)合的ZnPc分子可作為光動(dòng)力治療的光敏藥物，復(fù)合微球表面富含酸酐基團(tuán)經(jīng)簡單的水解反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)表面羧基功能化。進(jìn)一步的熒光共聚焦細(xì)胞成像以及MTT法細(xì)胞活性測試表明復(fù)合微球適合于成像與光動(dòng)力治療等潛在生物學(xué)應(yīng)用研究。

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Composite Microspheres Assembly and Photosensitive Activity Research Based on NaYF4:Yb3+,Er3+Upconverting Nanoparticles

ZHANG Qing-Bin＊CHENG Cheng
(Department of Applied Physics,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310023,China)

A multifunctional composite microspheres were prepared based on NaYF4∶Yb3+,Er3+upconversion nanoparticles(UCNPs),zinc phthalocyanine(ZnPc)and poly(maleic anhydride-alt-1-Octadecene)(PMAO)via a one step self-assembly process in microemulsion droplets.The UCNPs as fluorescence imaging agent can be used for biological imaging,and can also use the up-convering luminescence sensitization photosensitive molecules for the research of photosensitive activity.PMAO molecules provide anhydride functional groups for immobilization of biomolecules.The morphologies and property were characterized by transition electron microscopy(TEM),Zeta potential and photoluminescence(PL)spectroscopy.The fluorescence confocal cell imaging confirms that the NaYF4-ZnPc-PMAO are suitable for potential biological labeling.Photodynamic cancer cell killing ability was evaluated using a MTT assay with Hela cells under different time irradiations.The results indicating that the NaYF4-ZnPc-PMAO composite microspheres have highly killing ability to Hela cells under 980 nm light irradiation.

NaYF4∶Yb3+,Er3+;upconversion luminescencce;composite microspheres;biological imaging;photodynamic therapy

O611.4

A

1001-4861(2015)01-0081-06

10.11862/CJIC.2015.017

2014-06-30。收修改稿日期：2014-10-21。

國家自然科學(xué)基金(No.21305126)和浙江省教育廳科研補(bǔ)助(No.Y20125738)資助項(xiàng)目。＊

。E-mail：qbzhang@zjut.edu.cn