趙大海,陸友金

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽 合肥 230601)

抑制自噬促進(jìn)培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用

趙大海,陸友金

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽 合肥 230601)

目的 研究培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞A549自噬的作用及自噬的功能。方法 采用MTS法觀察培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用；采用透射電鏡和免疫印跡觀察培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞自噬體和自噬相關(guān)蛋白的影響；采用自噬抑制劑CQ抑制自噬后觀察培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果 培美曲塞抑制A549細(xì)胞的增殖；培美曲塞誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬體表達(dá)增加，并誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加，p62表達(dá)降低；自噬抑制劑CQ提高培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞抑制作用，使培美曲塞單藥組的抑制率由(28.42±2.45)%增加到CQ聯(lián)合培美曲塞組的(45.36±3.52)%。結(jié)論 培美曲塞可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549自噬增加，抑制自噬提高培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用，為肺癌的臨床治療提供新的聯(lián)合治療方案。

自噬；培美曲塞；肺癌；LC3; p62；氯喹

自噬是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過(guò)自噬作用被包裹、消化，最終降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循環(huán)利用，合成新的大分子和ATP，以維持細(xì)胞的正常代謝和生存[1]。自噬異常與腫瘤等疾病密切相關(guān)[2]。研究表明，抗腫瘤藥物可以不同程度引起腫瘤細(xì)胞自噬，抑制自噬可以提高抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性增加[3]。目前正在開展多項(xiàng)臨床研究以評(píng)價(jià)自噬抑制劑聯(lián)合分子靶向治療藥物或化療藥物對(duì)實(shí)體瘤的療效(www.clinicaltrials.gov)。培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium, PEM) 是一種新型多靶點(diǎn)抗代謝類藥物，主要通過(guò)抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰胺核苷甲?；D(zhuǎn)移酶，干擾復(fù)制過(guò)程中葉酸的代謝而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。培美曲塞聯(lián)合鉑類是肺腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療[4]。但是同所有抗腫瘤藥物類似，天然或獲得性耐藥是其療效不佳的重要原因。培美曲塞在肺癌治療過(guò)程中療效不佳的原因是否與誘導(dǎo)自噬相關(guān)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究觀察培美曲塞對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549自噬的作用，并在此基礎(chǔ)上探討自噬的功能，為臨床更加合理化的治療方案提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑人A549肺癌細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司;預(yù)染蛋白分子量Marker購(gòu)自Fermentas公司；PVDF 膜購(gòu)于Millipore公司；培美曲塞購(gòu)于美國(guó)禮來(lái)公司；氯喹(chloroquine, CQ)購(gòu)于Sigma Aldrich公司；LC3、Beclin-1、p62、GAPDH和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，24 h后將培養(yǎng)液換成含藥物的新鮮培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μL MTS試劑，37℃ 孵育0～4 h，每隔30 min用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值 (A490 nm)?？瞻捉M只含有培養(yǎng)基而無(wú)細(xì)胞，按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(inhibitory rate, IR)/%=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/細(xì)胞組A值)×100%。通過(guò)Graph Pad Prism 3.0 軟件繪制細(xì)胞增殖活性曲線，并算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.2.2 透射電鏡觀察自噬體 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞每孔1×105個(gè)接種于6孔板上培養(yǎng)過(guò)夜，加入指定濃度培美曲塞孵育24 h后，細(xì)胞收集在離心管內(nèi)，PBS沖洗后，用2.5%的戊二醛、1%的鋨酸雙固定，梯度乙醇脫水、滲透、包埋、聚合、超薄切片，染色，拍照。

1.2.3 免疫印跡分析 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后加入相應(yīng)的藥物和新鮮培養(yǎng)液，處理所需時(shí)間后，用冷PBS清洗，再用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心后收集上清，取等量蛋白上樣液進(jìn)行SDS PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，之后加入一抗于4℃ 搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃孵育2 h, 最后用Biological Industries ECL發(fā)光試劑盒顯影。富士化學(xué)發(fā)光成像儀Las-4000成像,觀察各條帶深淺變化并加以分析,GAPDH作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 培美曲塞對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用培美曲塞在0～9.6 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞株有增殖抑制作用，抑制率隨著藥物濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，呈劑量和時(shí)間依賴性(Fig 1)。培美曲塞0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol·L-1濃度時(shí)作用于A549 72 h后的抑制率依次為：(0.56±0.12)%、(8.24±0.98)%、(28.42±2.45)%、(39.56±3.21)%、(65.79±4.63)%。IC50為(6.43±2.57) μmol·L-1。

2.2 培美曲塞誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬

2.2.1 培美曲塞誘導(dǎo)自噬體增加 自噬在形態(tài)學(xué)上典型的表現(xiàn)是含有雙層膜的自噬體。有無(wú)雙層膜的自噬體是判斷自噬存在與否的金標(biāo)準(zhǔn)。為了觀察培美曲塞處理后A549細(xì)胞自噬體的變化，我們采用 1.2 μmol·L-1培美曲塞處理A549細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞采用透射電鏡觀察自噬體的變化。透射電鏡發(fā)現(xiàn)藥物處理組含有雙層膜的自噬體明顯增多，而對(duì)照組只能觀察到少數(shù)自噬囊泡形成(Fig 2)。這表明培美曲塞誘導(dǎo)自噬體增多。

Fig 1 Inhibitory effect of pemetrexed (PEM) on proliferation of A549 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 Autophagosome increases in PEM treated A549 cells

A: Numerous typical double-layer membrane autophagosomes (arrows) appeared in A549 cells treated with 1.2 μmol·L-1PEM for 24 h. (a:control, b: PEM treatment); B: The number of autophagosomes was calculated by continuous counts in 30 fields under high resolution. Bar = 1 μm.**P<0.01vscontrol

2.2.2 培美曲塞誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 自噬相關(guān)蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物的類似物為微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (light chain 3，LC3)。LC3在其C末端被ATG4剪切，形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ通過(guò)ATG7和ATG3同磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)相偶聯(lián)，形成LC3-Ⅱ,定位于自噬體的內(nèi)外層膜。LC3參與了前體膜的延長(zhǎng)和閉合，也參與了自噬體的形成。因此，ATG8/LC3是自噬的重要分子標(biāo)記物。p62是一種同LC3相互作用的蛋白，p62的表達(dá)同自噬活化呈負(fù)相關(guān)。Western blot分析表明，隨著培美曲塞濃度的增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加。Beclin-1蛋白隨著藥物濃度的增加表達(dá)增加。相反，p62表達(dá)隨著培美曲塞濃度的增加而降低(Fig 3)。這表明培美曲塞誘導(dǎo)自噬活化增加。

Fig 3 Autophagy related proteins are induced by exposure to PEM

Cells were incubated with the indicated concentration of PEM for 24 h. The transition of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ and Beclin-1 were increased and the expression of p62 was decreased.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 抑制自噬提高培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。在本研究中我們觀察到培美曲塞誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬活化增加，但并不清楚自噬活化促進(jìn)培美曲塞的抗腫瘤作用或?qū)е履[瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生。氯喹(chloroquine, CQ)是特異性自噬抑制劑，主要抑制了自噬體和溶酶體的結(jié)合，抑制自噬的降解，使得自噬體在細(xì)胞內(nèi)增加。Western blot分析表明，自噬抑制劑CQ聯(lián)合PEM組，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加更為明顯。MTS分析表明，自噬抑制劑CQ促進(jìn)了培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制作用。1.2μmol·L-1培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為(28.42±2.45)%，CQ聯(lián)合培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為 (45.36±3.52)% ,見Fig 4。

Fig 4 Inhibition of autophagy facilitates the inhibitory effect of PEM on A549 cells

A:Western blot for the transition of LC3-I to LC3-Ⅱ in A549 cells treated with 1.2 μmol·L-1PEM in the presence or absence of 5 μmol·L-1CQ; B:A549 cells were treated with 1.2 μmol·L-1PEM or DMSO in the presence or absence of CQ (5 μmol·L-1) for 72 h. Inhibitory rate was measured by MTS assay.*P<0.05,**P<0.01vsPEM treated alone.

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率位于第1位的惡性腫瘤[5]。鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療方案是目前晚期EGFR狀態(tài)未知肺非鱗癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。Ⅲ期臨床研究表明培美曲塞聯(lián)合鉑類化療方案能改善患者的總生存時(shí)間(over survival, OS)[6]。本研究表明，培美曲塞對(duì)A549表現(xiàn)出不同的抗腫瘤作用。培美曲塞對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴性。

自噬是廣泛存在于從酵母、線蟲、果蠅到高等脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中一種自我保護(hù)的過(guò)程[1]。饑餓、能量缺乏等代謝應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬活化[7]。大量的研究表明，抗腫瘤藥物如奧沙利鉑、氟尿嘧啶等可以不同程度地誘導(dǎo)自噬發(fā)生[8-9]。陳美娟等[10]通過(guò)對(duì)自噬效應(yīng)在非小細(xì)胞肺癌靶向治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述分析認(rèn)為，在非小細(xì)胞肺癌治療的過(guò)程中，要充分考慮到自噬的作用，對(duì)其進(jìn)行合理的調(diào)節(jié)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)培美曲塞處理肺癌細(xì)胞后透射電鏡可以觀察到自噬體的增加。此外，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明培美曲塞可以誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)增加，p62表達(dá)減少，同時(shí)促進(jìn)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換。這些結(jié)果表明培美曲塞誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬活化。

自噬是一種高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有兩面性。一方面，過(guò)度活化的自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡的發(fā)生，即“自噬性細(xì)胞死亡”[11]；另一方面，自噬通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)大分子成份為自身提供能量從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生及加速腫瘤細(xì)胞的增殖。在本研究中，我們觀察到培美曲塞誘導(dǎo)自噬活化增加，但是我們并不清楚自噬活化在這一過(guò)程中是導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)培美曲塞耐藥增加，還是導(dǎo)致自噬性死亡。我們發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑CQ處理后LC3-Ⅱ表達(dá)增加。培美曲塞組聯(lián)合CQ組LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加更為明顯。MTS實(shí)驗(yàn)表明自噬抑制劑CQ提高了培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，使得培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制率由單藥時(shí)的28%左右增加到聯(lián)合組的45%左右。這表明自噬活化導(dǎo)致A549肺癌細(xì)胞對(duì)培美曲塞的敏感性降低，抑制自噬使得培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用增加。這與現(xiàn)有的研究相一致，大多數(shù)研究認(rèn)為自噬使得腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性增加，抑制自噬可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤治療的敏感性，增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

總之，培美曲塞可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬發(fā)生。自噬活化使得肺癌細(xì)胞對(duì)培美曲塞的敏感性降低，抑制自噬可以提高培美曲塞對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。培美曲塞誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制及抑制自噬提高培美曲塞抗腫瘤作用是否與促進(jìn)凋亡相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科劉榮玉教授的關(guān)心和指導(dǎo)，感謝中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院周江寧老師及實(shí)驗(yàn)室的各位同仁的幫助與支持。)

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Autophagy inhibition facilitates the anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells

ZHAO Da-hai, LU You-jin

(DeptofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Aim To explore the effect of pemetrexed on autophagy and the function of autohpagy activation in A549 cells. Methods The anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells was detected by MTS. The formation of autophagosome was observed by transmission electron microscopy (TEM) and the expression of autophagy-related proteins was determined by Western blot. The inhibitory effects of the combination of pemetrexed and a selective autophagy inhibitor on A549 cells were measured by MTS. Results Pemetrexed inhibited the proliferation of A549 cells. Autophagy was activated in A549 cells by exposure to pemtrexed. Autophagosome was increased in pemetrexed treatment cells compared with control group. Pemtrexed treatment led to the formation of autophagosome and the conversion of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ. The increase of Beclin-1 and the decline of autophagy substrate of p62 were observed in pemtrexed treated A549 cells. The pharmacological autophagy inhibitor chloroquine (CQ) sensitized A549 cells to pemetrexed treatment. The inhibitory rate was (28.42±2.45)% for pemetrexed only, and (45.36±3.52)% for pemetrexed combined with CQ. Conclusions Pemetrexed could activate autophagy in A549 cell lines. The disruption of autophagy facilitates the anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells, which provides a novel strategy in lung cancer treatment.

autophagy; pemetrexed; lung cancer; LC3; p62；chloroquine

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.012.html

2014-12-21,

2015-01-28

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No KJ2013A145)

趙大海(1973-),男,博士生,副主任醫(yī)師,研究方向：肺癌的治療，E-mail:879766645@qq.com; 陸友金(1962-),男,碩士，主任醫(yī)師,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向：肺癌的治療，通訊作者，E-mail: luyougolden@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.015

A

1001-1978(2015)05-0664-05

R329.24；R329.25；R734.2；R979.1