榮二花，李靈嬌，楊娜，陳弟，吳玉香＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，河南 安陽 455000;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉屬三元雜種的合成及細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

榮二花1，李靈嬌3，楊娜3，陳弟2，吳玉香3＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，河南 安陽 455000;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉屬有豐富的種質(zhì)資源，野生棉具有栽培棉種所缺乏的許多優(yōu)良性狀，為了將野生澳洲棉和達(dá)爾文棉的優(yōu)良性狀導(dǎo)入陸地棉，以期改良栽培種陸地棉。本研究通過陸地棉和C組野生澳洲棉遠(yuǎn)緣雜交獲得雜種F1，并對其進(jìn)行染色體加倍，將加倍成的異源六倍體與野生四倍體達(dá)爾文棉雜交，獲得陸地棉、澳洲棉、達(dá)爾文棉的三元雜種，并對該雜種進(jìn)行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明：三元雜種有三個(gè)親本的遺傳特性?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂結(jié)果表明后期存在異常行為，主要表現(xiàn)在65%的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期染色體不能均等分離，使得末期形成大量的多分體，這些多分體會進(jìn)一步發(fā)育為敗育花粉粒，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明正?；ǚ哿Ｖ徽?8.3%，導(dǎo)致該雜種高度不育。本研究不僅合成了綜合三個(gè)親本特性的三元雜種，也為該雜種不育提供了細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)，并為棉花新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了理論依據(jù)和中間材料。

陸地棉;澳洲棉;達(dá)爾文棉;三元雜種;形態(tài)學(xué);減數(shù)分裂

棉花屬雙子葉植物（Dicotyledons)、錦葵科（Malvaceae)、棉屬（Gossypium)。棉屬有4個(gè)亞屬，8個(gè)組，9個(gè)亞組，51個(gè)種，其中46個(gè)為二倍體棉種，5個(gè)為四倍體棉種［1］。棉屬有四個(gè)栽培品種即亞洲棉、草棉、陸地棉、海島棉，其余47個(gè)均為野生棉種［2］。由于栽培棉種對病蟲害及非生物脅迫較為敏感［3］，而野生棉種有多種多樣優(yōu)異的農(nóng)藝性狀，如抗干旱、鹽堿，抗病蟲，抗寒，種子無棉酚而植株具棉酚，以及纖維品質(zhì)優(yōu)異等。通過遠(yuǎn)緣雜交，期望將不同棉種所特有的有益性狀進(jìn)行遺傳重組，創(chuàng)造出品種間雜交無法得到的新種質(zhì)，是棉花遺傳育種的重要途徑［4］。

陸地棉為四個(gè)栽培棉種之一，是世界90%以上的栽培棉種，也是最重要的纖維作物。澳洲棉和達(dá)爾文棉均為野生棉種，澳洲棉具有抗病蟲及抗干旱、抗短期低溫等優(yōu)良特性，并能提高衣分和強(qiáng)力［5］。利用野生棉改良陸地棉國內(nèi)外都有很多成功的報(bào)道：如早在60年代 Muramoto［6］將澳洲棉和陸地棉雜交，F(xiàn)1加倍，再對六倍體進(jìn)行選擇，第四代具備比陸地棉和海島棉更大的耐寒性，抗根腐病菌，且改進(jìn)了纖維品質(zhì)。梁理民等人［7］通過陸地棉和斯特提棉種間雜交育成新品種秦遠(yuǎn)號，同時(shí)選育出抗病優(yōu)質(zhì)、抗病高強(qiáng)、抗病大鈴、抗病高衣分，抗枯黃萎病的棉花新種質(zhì)。迄今為止，我國已獲得陸地棉與19個(gè)野生棉種及其他栽培種的高代種間雜種（4代以上)［8］。

本研究通過遠(yuǎn)緣雜交試圖將野生澳洲棉和達(dá)爾文棉的優(yōu)良性狀導(dǎo)入陸地棉，合成綜合野生棉和陸地棉優(yōu)良性狀的新種質(zhì)，并對雜種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和減數(shù)分裂行為探討，以期尋求雜種不育的直接原因，并進(jìn)一步探討育性恢復(fù)的有效方法，為棉花遺傳改良及新種質(zhì)創(chuàng)制提供理論依據(jù)和有價(jià)值材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料有：陸地棉（G.hirsutum)（2n＝4x＝52)、C組野生澳洲棉（G.australe)（2n＝2x＝26)、四倍體野生達(dá)爾文棉（G.darwinii)（2n＝4x＝52)。野生棉材料來源于國家種質(zhì)三亞野生棉圃，其染色體組及地理分布見表1。

表1 供試材料及其地理分布Table 1 The materials and geographic distribution

三元雜種合成過程如下：

1.2 三元雜種的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

對三元雜種植株和其三個(gè)親本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定并比較，分別選取同一節(jié)位（第五節(jié))的三個(gè)親本葉片和雜種葉片進(jìn)行比較，并選取同一節(jié)位（第五節(jié))的三個(gè)親本花朵和雜種花朵進(jìn)行比較，包括花瓣、雌雄蕊等性狀差異較大的部位分別進(jìn)行比較，判斷親本的遺傳物質(zhì)及形態(tài)性狀在雜種中的表現(xiàn)。

1.3 三元雜種的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂制片及觀察

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察制片和照相采用李懋學(xué)等［9］的方法。挑選各個(gè)時(shí)期分散好的片子用OLYMPUS DP71顯微鏡觀察并拍照，分別選取60個(gè)視野，觀察減數(shù)分裂后期染色體分離狀況，記錄多分體出現(xiàn)的種類及數(shù)目，并計(jì)算其各自所占比例。

1.4 三元雜種的花粉粒制片及觀察

花粉粒觀察制片和照相也采用李懋學(xué)等［9］的方法。挑選花粉粒分散好的片子用OLYMPUS DP71顯微鏡觀察并拍照，選取40個(gè)視野觀察統(tǒng)計(jì)花粉粒類型和出現(xiàn)的頻率，并計(jì)算其各自所占比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 三元雜種的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

三元雜種植株長勢良好，表現(xiàn)出了強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。選取同一節(jié)位葉片及花朵進(jìn)行比較（圖1)。從圖1中可以看出：雜種葉片為闊心型，有異源六倍體中間親本的特性，綜合親本陸地棉葉片闊和澳洲棉橢圓形狀的特征?；ǘ涞凵?，比異源六倍體中間親本淡，但比親本澳洲棉深，親本澳洲棉紫色，雜種沒有明顯花斑，不像親本澳洲棉，雌蕊柱頭像母本陸地棉，雄蕊遺傳了陸地棉黃色花藥和野生達(dá)爾文棉親本花絲短的特性，但更像中間親本異源六倍體。

圖1 雜種葉片及花朵和親本比較Fig.1 Leaf and flower comparison with its parents

2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察

正常花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂在末期Ⅱ會形成由4個(gè)細(xì)胞核組成的四分體，最終產(chǎn)生4個(gè)子細(xì)胞。而微核是由染色體后期Ⅱ向多極不均等分離形成的，一個(gè)花粉母細(xì)胞內(nèi)可能形成了5個(gè)或5個(gè)以上大小不等的核，三元雜種的花粉母細(xì)胞，在減數(shù)第二次分裂后期，染色體向多極不均等分離，觀察到不同數(shù)目的微核;即多分體，本研究選取60個(gè)視野中200個(gè)多分體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)四分體70個(gè)，比例為35%，多分體及有微核出現(xiàn)的多達(dá)130，頻率為65%。不同多分體出現(xiàn)的個(gè)數(shù)和比例的統(tǒng)計(jì)如表2。

表2 雜種花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期多分體出現(xiàn)情況Table 2 Number of multispores in telophase II of hybrid in pollen mother cells

圖2 三元雜種減數(shù)分裂后期出現(xiàn)的各種多分體Fig.2 Various multispores in meiosis of telophase II in hybrid

2.3 三元雜種花粉粒的觀察

三元雜種植株在自然授粉情況下不結(jié)鈴，大量雜交、自交不結(jié)種子，說明三元雜種不育，導(dǎo)致這種不育的原因之一是性細(xì)胞減數(shù)分裂異常。探究其花粉粒形狀和飽滿度可以為其育性恢復(fù)提供理論依據(jù)。

三元雜種花粉粒發(fā)育不整齊，大小不一，形狀各異，既存在發(fā)育飽滿的大花粉粒，也存在極小的敗育花粉粒，正?；ǚ哿４笮【鶆?，形狀規(guī)則均為飽滿的球形，如圖3所示左邊為正?；ǚ哿?，即完整的飽滿球形花粉粒，右邊為無刺突花粉粒以及不完整的破裂花粉?；蚋砂T的橢圓狀花粉粒。對40個(gè)視野中的230個(gè)花粉粒的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3，表明三元雜種正常的花粉粒只占18.3%，大部分為異常花粉粒。這是三元雜種不育的直接原因。

表3 三元雜種花粉粒類型及出現(xiàn)頻率Table 3 The number and frequency of different pollen grains in trispecific hybrid

圖3 三元雜種花粉粒類型Fig.3 Pollen grain type in hybrid.

3 討論

3.1 三元雜種F1不育原因及育性恢復(fù)方法探討

雜種不育在種間雜種中普遍存在，部分或完全阻斷了不同種間遺傳信息的交換。原因在于異種間遺傳性的不協(xié)調(diào)，在棉屬中常見的有細(xì)胞核不育和細(xì)胞質(zhì)不育。前者指的是雙親染色體結(jié)構(gòu)上的差異，染色體組型之間的不相適應(yīng)，即不具有或缺少同源性，減數(shù)分裂時(shí)不能正常配對或配對后不能正常分裂，產(chǎn)生畸形花粉粒和畸形雌雄配子，導(dǎo)致雜種不育。細(xì)胞質(zhì)不育性則是由于異種間的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不協(xié)調(diào)而產(chǎn)生［10］。本研究中三元雜種高度不育的直接原因在于減數(shù)分裂紊亂，染色體分離不均等，向多極移動產(chǎn)生多分體，最終形成的配子得不到全套染色體，花粉粒無活力。三元雜種F1不育性主要體現(xiàn)在花粉沒有生活力。有望通過以下途徑加以克服：強(qiáng)制自交和大量回交;控制營養(yǎng)和環(huán)境條件;染色體加倍等。Benbouza等［11］報(bào)道通過遠(yuǎn)緣雜交獲得雷蒙地棉、斯特提棉、陸地棉三元雜種，通過人工授粉使三元雜種與親本陸地棉大量回交以及自交，成功獲得了可育的穩(wěn)定遺傳后代。采用三元雜種與栽培棉親本回交也可獲得很好的效果［12］。吳玉香等［｀13］研究證明延長種間雜種植株的生長時(shí)間有利于協(xié)調(diào)不同來源的染色體組之間的關(guān)系，使染色體組趨于平衡，育性得到大幅度恢復(fù)。本研究中的三元雜種有望通過以上方法恢復(fù)其育性，選育出可育的雜種遺傳后代，為棉花遺傳育種及新種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)和有價(jià)值材料。

3.2 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的方法

雜交不親和是遠(yuǎn)緣雜交育種的首要難題。主要分為受精前障礙和受精后障礙兩類［14］?？朔芫罢系K的方法有：（1)改良授粉方式，如混合授粉、授 蒙 導(dǎo) 花 粉、蕾 期 授 粉 和 重 復(fù) 授 粉［15，16］，Sundaram等［17］探究了三葉棉、戴維遜氏棉、瑟伯氏棉、辣根棉四種野生棉在海島棉雌蕊上的花粉管行為，認(rèn)為蕾期授粉、試管內(nèi)授粉可有效促進(jìn)授粉成功。（2)應(yīng)用激素類物質(zhì)如赤霉素、萘乙酸或秋水仙素等涂抹或噴灑柱頭［15］，通過吸引花柱中促進(jìn)花粉管生長的物質(zhì)促進(jìn)花粉管生長，抑制花的脫落，提高受精率［18］。山西省農(nóng)科院［19］在培育特早熟抗蚜棉花新品種晉棉51號過程中，對獲得的陸地棉×異常棉的遠(yuǎn)緣雜種后代采用雜交鈴噴（滴)GA3和NAA、離體培養(yǎng)雜交當(dāng)代幼胚技術(shù)，成功克服了雜交當(dāng)代不親和性。（3)體細(xì)胞雜交技術(shù)使得不兼容物種間的基因融合以及細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)性狀的轉(zhuǎn)移成為可能［16］，孫玉強(qiáng)等［20］通過體細(xì)胞雜交技術(shù)成功地將野生三裂棉和陸地棉原生質(zhì)體融合，將三裂棉優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)入陸地棉，雜種植株具有比雙親更強(qiáng)的光合能力及營養(yǎng)器官。（4)在授粉前對花粉、花柱進(jìn)行一定的物理處理，如適當(dāng)加熱、電磁輻射、紫外線和γ射線照射等，可以提高受精率，對克服受精前障礙有積極幫助［21］。受精后障礙的克服常采用幼胚拯救技術(shù)，包括子房培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)，這在菊科雜交種獲得成功［22，23］。此外，染色體數(shù)目不同的雙親雜交，染色體數(shù)目多的一方做母本成功率較大;多倍體起到基因轉(zhuǎn)移的載體作用和基因漸滲的媒介作用，可以把野生種中簡單遺傳的抗病基因轉(zhuǎn)移到栽培種中［24］，Robinson等［25］通過六倍體做橋梁獲得陸地棉、長萼棉和辣根棉三元雜種，該雜種能抗線蟲，大大解弱了美國棉花受線蟲的危害。本研究以染色體多的陸地棉做母本，和二倍體澳洲棉雜交制成雜種三倍體，再對其進(jìn)行染色體加倍，獲得了可育的異源六倍體雜種，但該六倍體雜種與達(dá)爾文棉雜交后獲得不育三元雜種，有待進(jìn)一步尋找恢復(fù)育性的有效方法。

［1］Fryxell P A.A revised taxonomic interpretation of Gossypium L.（Malvaceae)［J］.Pheedea，1992，2（2)：108-165.

［2］王坤波，杜雄明，宋國立.棉花種質(zhì)創(chuàng)新的現(xiàn)狀與未來［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（增刊)：23-28.

［3］Yuqiang Sun，Shoumei Liu，Yu Wang，et al.An interspeci？c somatic hybrid between upland（G.hirsutumL.cv.ZDM-3)and wild diploid cotton（G.klotzschianumA.)［J］.Plant Cell and Organ Culture，2011，106（2)：425-433.

［4］梁正蘭.棉花遠(yuǎn)緣雜交的遺傳與育種［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：1-2.

［5］梁正蘭，孫傳渭.棉花遠(yuǎn)緣雜交［M］.北京：科學(xué)出版社，1982：32.

［6］Muramoto H.Hexaploid cotton：some plant and fiber properties［J］.Crop Sci，1969，9（1)：27

［7］梁理民，劉有良，王增信，等.陸地棉×斯特提棉種間雜交創(chuàng)造抗枯黃萎病新種質(zhì)［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（4)：16-18.

［8］龐朝友，杜雄明，馬峙英.具有野生棉外源基因的陸地棉特異種質(zhì)創(chuàng)造與利用進(jìn)展［J］.棉花學(xué)報(bào)，2005，17（3)：171-177.

［9］李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：63-66.

［10］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所.中國棉花遺傳育種學(xué)［M］.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2003：270

［11］H Benbouza，J M Lacape，J M Jacquemin，et al.Introgression of thelow-gossypolseed＆high-gossypolplanttrait in upland cotton：Analysis of［（Gossypiumhirsutum×G.raimondii)2×G.sturtianum］trispecific hybrid and selected derivatives using mapped SSRs［J］.Molecular Breeding，2010，25（2)：273-286.

［12］Ganesh S Newaskar，Vivek P Chimote，Subhash S Mehetre，et al.Interspecific hybridization inGossypiumL.：characterization of progenies with different ploidy-confirmed multigenomic backgrounds［J］.Plant Breeding，2013，132（2)：211-216.

［13］吳玉香，陳崇乾，高燕會，等.活體保存對栽培棉種間四元雜種育性和染色體構(gòu)型的影響［J］.棉花學(xué)報(bào)，2007，19（6)：461-466.

［14］鄧衍明，葉曉青，佘建明，等.植物遠(yuǎn)緣雜交育種研究進(jìn)展［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（增刊)：52-55.

［15］湯訪評.菊屬與四個(gè)近緣屬植物遠(yuǎn)緣雜交研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［16］李玉暉，陳學(xué)森，鄭洲.果樹遠(yuǎn)緣雜交育種研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（1)：139-143.

［17］Sundaram Ganesh Ram V，Thiruvengadam S，Hari Ramakrishnan，et al.Investigation on pre-zygotic barriers in the interspecific crosses involvingGossypiumbarbadenseand four diploid wild species［J］.Euphytica，2007，159：241-248.

［18］孟金陵.植物生殖遺傳學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［19］郭寶德，黃穗蘭，冀麗霞.抗蚜棉花新品種晉棉51號的選育及高產(chǎn)栽培技術(shù)［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9)：933-935，971.

［20］X S Yu，B J Chu，R E Liu，et al.Characteristics of fertile somatic hybrids ofG.hirsutumL.andG.Trilobumgenerated via protoplast fusion［J］.Theoretical and Applied Genetics，2012，125（7)：1503-1516.

［21］Atanassov II，Atanassova SA，Dragoeva AI，et al.A new CMS source in Nicotiana developed via somatic cybridization betweenN.tabacumandN.alata［J］.Theor Appl Genet，1998，97：982-985.

［22］Henn HJ，Wingender R，Schnabl H.Regeneration of fertile interspecific hybrids from cell fusion betweenHelianthusannuusL.and wildHelianthusspecies［J］.Plant Cell Rep 1998，18：220-224.

［23］Cheng X，Chen S M，Chen F D，et al.Interspecific hybrids betweenDendranthemamorifolium（Ramat.)Kitamura andD.nankingense（Nakai)Tzvel.Achieved using ovary rescue and their cold tolerance characteristics［J］.Euphytica，2010，172：101-108.

［24］孫敏紅，張蜀寧.多倍體育種在園藝作物中的應(yīng)用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1)：68-72.

［25］Robinson A F.Reniform in U.S.cotton：when，where，why，and some remedies［J］.Ann Rev Phytopathol，2007，45：111-125.

Synthesis and Cytogenetic Identification of Trispecific Hybrid in Cotton

Rong Erhua1，Li Lingjiao3，Yang Na3，Chen Di2，Wu Yuxiang3＊
（1.Experimentalandteachingcenter，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CottonResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalScience，AnyangHenan455000，China;3.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

There are rich germplasm resources inGossypiumand wild cotton species possess many valuable agronomic traits which cultivated cotton always lacks.In order to introgress the useful traits from wild speciesG.australeandG.darwiniiinto cultivated species，tetraploidG.hirsutumwas crossed directly with C-genome speciesG.australeas male parent，creating a triploid hybrid.Chromosome doubling of this triploid hybrid leads to a allohexaploid which was then crossed with wild tetraploid speciesG.darwinii，resulting in trispecific hybrid（G.hirsutum，G.australe，G.darwinii).The morphology characteristic and cytogenetic identification of trispecific hybrid was further investigated in this study.The hybrid morphology performed combining characteristics from three parents.Results indicated that the meiosis of trispecific hybrid was abnormal，and 65%abnormal multispores appeared in the telophase II，which finally developed into abortive pollen grains.The result also showed that there were only 18.3%normal pollen grains in this hybrid by statistic analysis.It leads to the sterility of trispecific hybrid F1.This study not only creats new cotton germplasms fromG.hirsutum，G.australe，G.darwiniiwith three parents characteristic.It also provides the main reason of sterility for this hybrid.

G.hirsutum;G.australe;G.darwiniiWatt;Trispecific Hybrid;Morphology;Meiosis

S334.3

A

1671-8151（2015)05-0449-05

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.001

2015-06-03

2015-07-09

榮二花（1974-)，女（漢)，山西太谷人，博士，研究方向：作物信息技術(shù)。

＊通訊作者：吳玉香，教授，博士。Tel：15034664402，E-mail：yuxiangwu2009＠hotmail.com

國家自然科學(xué)基金（No.31171599，31301364);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（2014YZ04);博士基金（2013YJ45);博士后基金（125375)

（編輯：邢國芳)