胡艷華，李敏，，張虎芳＊，李生才，王青，趙惠玲

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.太原師范學(xué)院 生物系，山西 太原 030031)

粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的信息分析

胡艷華1，李敏1，2，張虎芳1＊，李生才1，王青2，趙惠玲2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.太原師范學(xué)院 生物系，山西 太原 030031)

粘蟲(chóng)Mythimnaseparata（Walker)是一種遷飛性害蟲(chóng)，嚴(yán)重危害玉米、水稻、小麥等糧食作物。SSR是指以1～6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。SSR位點(diǎn)的信息分析為粘蟲(chóng)擴(kuò)散、遷飛和交配等行為分子機(jī)制的研究以及粘蟲(chóng)的綜合防治奠定理論基礎(chǔ)。本研究基于高通量測(cè)序獲得的粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用軟件msatcommander發(fā)掘粘蟲(chóng)SSR位點(diǎn)。結(jié)果從20 776條轉(zhuǎn)錄組Unigenes中共搜索出400個(gè)SSR，分布于372條Unigenes中。在粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組SSR中，三核苷酸重復(fù)的數(shù)量最為豐富，有271個(gè);其次是二核苷酸和單核苷酸重復(fù)，分別是70個(gè)和49個(gè);四至六核苷酸重復(fù)的數(shù)量都很少，共10個(gè)。粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組SSR共包含24種重復(fù)基元，其中CCG／CGG是優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元類(lèi)型，有69個(gè);其次是AAG／CTT，有57個(gè)。CG／CG有18個(gè)，在二核苷酸重復(fù)基元中所占的比例達(dá)到25.7%。此研究發(fā)掘到的SSR位點(diǎn)將為粘蟲(chóng)遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析等提供豐富的分子標(biāo)記。

粘蟲(chóng);轉(zhuǎn)錄組;SSR;重復(fù)類(lèi)型;重復(fù)基元

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR)又稱(chēng)微衛(wèi)星（Microsatellites DNA)，是指以1～6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，如 An、（AT)n、（TGG)n和（ATTC)n等重復(fù)［1］。SSR廣泛存在于真核生物和部分原核生物核基因組中，是一種有效的基于DNA長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記，具有高度多態(tài)性、雜合性高、分布廣泛、變異豐富、呈共顯性遺傳和檢測(cè)快速方便諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜繪制、種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、基因定位與克隆、分子標(biāo)記輔助育種、親緣關(guān)系分析等研究領(lǐng)域［2，3］。

粘蟲(chóng)Mythimnaseparata（Walker)屬于鱗翅目夜蛾科，具有遷飛性和暴發(fā)性，是糧食作物的主要害蟲(chóng)，嚴(yán)重威脅我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全，在亞洲和澳洲其它國(guó)家也常發(fā)生危害［4］。2012年三代粘蟲(chóng)在我國(guó)暴發(fā)成災(zāi)，發(fā)生面積和危害程度為近十年之最［5］。粘蟲(chóng)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)有利于構(gòu)建粘蟲(chóng)的遺傳圖譜，探究其種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，從分子水平探究粘蟲(chóng)擴(kuò)散、遷飛和交配等行為，為制定科學(xué)合理的檢測(cè)及防控措施奠定理論基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的從基因組DNA序列中開(kāi)發(fā)SSR的方法存在步驟繁瑣、成本高、效率低以及耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并鑒定SSR位點(diǎn)為SSR位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效的途徑和豐富的遺傳學(xué)資源。同時(shí)，由于基于轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)的SSR位于蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，這些編碼區(qū)中包含著已知或者未知的基因功能，因而可用于鑒定功能基因，從而可進(jìn)一步進(jìn)行表型研究。

至今，基于轉(zhuǎn)錄組對(duì)EST-SSR位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)已有相關(guān)報(bào)道。Bai et al［7］通過(guò)對(duì)溫帶臭蟲(chóng)（Cimex lectulariusLinnaeus)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到370個(gè)SSR，其中三核苷酸重復(fù)的數(shù)量最豐富。Wei et al［8］基于嗜蟲(chóng)書(shū)虱（Liposcelisentomophila（Enderlein))轉(zhuǎn)錄組篩選得到1 110個(gè)EST-SSR，并成功設(shè)計(jì)出231對(duì)引物。Xu et al［9］從白背飛虱（Sogatellafurcifera（Horváth))轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索得到7 291個(gè)SSR位點(diǎn)，并且預(yù)測(cè)有7.26%的蛋白質(zhì)編碼序列位于這些SSR中。Duan et al［10］從綠豆象（CallosobruchuschinensisLinnaeus)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索并鑒定出6 303個(gè)SSR遺傳標(biāo)記，并從中篩選出20對(duì)高度多態(tài)性的SSR遺傳標(biāo)記已經(jīng)成功用于分析綠豆象種群的遺傳多樣性。Sun et al［11］從 褐 飛 虱 （Nilaparvatalugens（St?l))轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘得到 465個(gè) SSR，將含有SSR的序列與NCBI中nonredundant（nr)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)37.2%的序列是已知功能的基因，62.4%的基因功能未知。對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的研究報(bào)道中，Xie et al［12］從小菜蛾（PlutellaXylostella（Linnaeus))轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘出2 351個(gè)SSR位點(diǎn)，三核苷酸重復(fù)的數(shù)量最豐富。Li et al［13］基于二點(diǎn)委夜蛾（Athetislepigone（M?schler))轉(zhuǎn)錄組發(fā)掘到2 819個(gè)SSR，分布于2 411條序列中。Zhu et al［14］從細(xì)梢小卷蛾（RhyacionialeptotubulaLiu et Bai)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘到1 450個(gè)SSR位點(diǎn)，其中（ATC)n是出現(xiàn)最多的重復(fù)基元。Pascual et al［15］從甜菜夜蛾（Spodopteraexigua（Hübner))轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘到351個(gè)SSR位點(diǎn)，25%的SSR位于預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框（ORFs)中。

本研究通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)粘蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用從頭組裝軟件獲得粘蟲(chóng)的Unigenes，通過(guò)搜索軟件對(duì)其EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行大批量搜索，并對(duì)其進(jìn)行分析，以便了解粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)的組成和分布特征，為后續(xù)粘蟲(chóng)的SSR引物的設(shè)計(jì)、遺傳多樣性分析以及功能基因的研究提供有效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)來(lái)源和總RNA提取

試蟲(chóng)引自西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心飼養(yǎng)多年的粘蟲(chóng)，飼養(yǎng)期間不接觸任何藥劑。取粘蟲(chóng)卵、1～6齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)，采用trizol法抽提粘蟲(chóng)總RNA。利用Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量，當(dāng)總RNA的濃度大于等于200mg·L－1、OD260／280值在1.8～2.2之間時(shí)，表明所提取的RNA符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列組裝拼接

總RNA樣品達(dá)到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求后采用華大基因Illumina HiSeq2000測(cè)序儀進(jìn)行高通量深度測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量讀段和去重復(fù)等處理，之后使用組裝軟件Trinity［16］對(duì)這些短序列進(jìn)行從頭de nove組裝，最終得到盡可能長(zhǎng)的非冗余序列Unigenes。

1.3 粘蟲(chóng)全轉(zhuǎn)錄組EST-SSR的發(fā)掘

利用msatcommander軟件［17］對(duì)粘蟲(chóng)全轉(zhuǎn)錄組Unigenes序列進(jìn)行SSR搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)如表1，符合上述搜索標(biāo)準(zhǔn)的在本次研究中被定義為SSR。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)粘蟲(chóng)總RNA質(zhì)量后，檢測(cè)結(jié)果為：總RNA濃度為831.5 mg·L－1，OD260／280值為2.01，表明粘蟲(chóng)總RNA樣品質(zhì)量很高，能夠滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。

2.2 原始序列組裝結(jié)果

粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組原始序列經(jīng)組裝拼接以后獲得了20 776條Unigenes。這些Unigenes的總長(zhǎng)度為14 002 443bp，平均長(zhǎng)度為674bp。Unigenes序列長(zhǎng)度均大于等于200bp，最長(zhǎng)的Unigenes 6 868bp。這些Unigenes序列用于后續(xù)的SSR搜索。

表1 發(fā)掘粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組SSR的搜索標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The search criteria of SSR fromMythimnaseparatatranscriptome

2.3 粘蟲(chóng)EST-SSR位點(diǎn)數(shù)量分布特征

粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigenes序列經(jīng)msatcommander軟件搜索，得到400個(gè)SSR，占總Unigenes數(shù)量的1.925%，即出現(xiàn)頻率。這400條SSR位點(diǎn)分布于372條Unigenes中，發(fā)生頻率為1.790%，發(fā)生頻率指含有SSR的Unigenes數(shù)量與總Unigenes數(shù)量的比值。其中，含單個(gè)SSR位點(diǎn)的Unigenes有365條，含2個(gè)SSR位點(diǎn)的Unigenes有10條，含3個(gè)SSR位點(diǎn)的Unigenes有5條。從分布情況看，粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigenes中平均每35 006bp（35kb)就出現(xiàn)1個(gè)SSR，即平均距離，但不同重復(fù)類(lèi)型間差異較大。

從粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中共搜索到六種核苷酸重復(fù)類(lèi)型，出現(xiàn)數(shù)量最多的是三核苷酸重復(fù)類(lèi)型，占總SSR數(shù)量的67.75%，其次是二核苷酸重復(fù)，占總SSR數(shù)量的17.50%，數(shù)量最少的是五核苷酸重復(fù)，只占總數(shù)的0.25%（表2)

表2 粘蟲(chóng)EST-SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布Table 2 The amount and distribution of the EST-SSR inMythimnaseparata

另外，不同核苷酸重復(fù)的重復(fù)次數(shù)有所差異，單核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在12～13次，二、三核苷酸重復(fù)主要集中在5～7次，四、五、六核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要以4次為主（表2)。

2.4 粘蟲(chóng)EST-SSR重復(fù)基元的分布特征

在400個(gè)粘蟲(chóng)EST-SSR位點(diǎn)中，共有24種重復(fù)基元出現(xiàn)，其中單、二、三、四、五及六核苷酸重復(fù)基元的種類(lèi)分別是2、4、10、5、1和2（表3)。其中，出現(xiàn)頻率最多的重復(fù)基元是CCG／CGG，其次是AAG／CTT（圖1)。單核苷酸重復(fù)基元中，A／T是優(yōu)勢(shì)基元，占單核苷酸重復(fù)的87.75%;二核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)的次數(shù)最多的是AC／GT，占二核苷 酸 重 復(fù) 的 55.71%，其 次 是 CG／CG，占25.71%。三核苷酸重復(fù)基元中，最高為CCG／CGG，占三核苷酸重復(fù)的25.46%;四、五和六核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型數(shù)量最少，總計(jì)占總SSR數(shù)量的2.5%（表3)。

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，從粘蟲(chóng)全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)20 776條Unigenes中共發(fā)掘出400個(gè)EST-SSR，出現(xiàn)頻率為1.93%，這比從黑翅土白蟻（Odontotermesformosanus（Shiraki))（9.98%)［18］、扶桑綿粉蚧（PhenacoccussolenopsisTinsley)（6.33%)［19］、煙 粉 虱 （Bemisiatabaci（Gennadius))（5.07%)［20］和嗜蟲(chóng)書(shū)虱（2.03%)［8］轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘的SSR出現(xiàn)頻率要低，但比黃粉蟲(chóng)（TenebriomolitorLinnaeus)（1.67%)［21］、云南切梢小蠹（TomicusyunnanensisKirkendall and Faccoli)（1.29%)［22］和 蔥 地 種 蠅 （DeliaantiguaMeigen)（1.12%)［23］的SSR 出現(xiàn)頻率要高。鱗翅目昆蟲(chóng)中，細(xì)梢小卷蛾SSR的出現(xiàn)頻率是3.09%，高于粘蟲(chóng)SSR的出現(xiàn)頻率［14］。分析原因，除了由于SSR搜索方法或標(biāo)準(zhǔn)有所差異外，最根本的原

因可能是物種本身的差異。

表3 粘蟲(chóng)EST-SSR重復(fù)基元的分布特征Table 3 Distribution Characteristics of EST-SSR's motif types inMythimnaseparata

圖1 粘蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組SSR中不同重復(fù)類(lèi)型及不同重復(fù)基元的分布Fig.1 Distribution of SSR among different nucleotide types found in the transcriptome of Mythimnaseparata

粘蟲(chóng)EST-SSR的種類(lèi)較為豐富，一至六核苷酸重復(fù)類(lèi)型都有出現(xiàn)，其中數(shù)量最多的重復(fù)類(lèi)型是三核苷酸重復(fù)序列。這與二點(diǎn)委夜蛾、灰飛虱（Laodelphaxstriatellus（Fallén))和大豆蚜（A-phisglycinesMatsamura)等昆蟲(chóng)的EST-SSR以三核苷 酸 重 復(fù) 為 主 類(lèi) 似［13，24，25］，而 與 扶 桑 綿 粉蚧［19］、黃 粉 蟲(chóng)［21］、黑 翅 土 白 蟻［20］、蠋 蝽 （Arma chinensisFallou)［26］的 EST-SSR 分布不同。其中扶桑綿粉蚧和黃粉蟲(chóng)EST-SSR中都是單核苷酸重復(fù)序列占主導(dǎo)地位，黑翅土白蟻和蠋蝽ESTSSR中占主導(dǎo)地位的是二核苷酸重復(fù)。由此可見(jiàn)不同物種間EST-SSR類(lèi)型的分布存在著差異。大部分昆蟲(chóng)中三核苷酸重復(fù)序列數(shù)量最豐富，可能是為了防止蛋白質(zhì)編碼時(shí)發(fā)生移碼突變［11］。

粘蟲(chóng)EST-SSR主要重復(fù)基元以1～3核苷酸為主，占總EST-SSR的99%以上。單核苷酸重復(fù)中A／T是主要的重復(fù)基元，這與已研究的90%以上昆蟲(chóng)的單核苷酸重復(fù)以A／T為主類(lèi)似。在二核苷酸重復(fù)類(lèi)型中，AC／GT重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率最高，與鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)梢小卷蛾［14］AC／GT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元相似。但與褐飛虱［12］和黃粉蟲(chóng)［21］以 AG／CT為主導(dǎo)重復(fù)基元以及與桔小實(shí)蠅［9］、扶桑綿粉蚧［19］、云南切梢小蠹［22］以 AT／AT 為主導(dǎo)重復(fù)基元不同。三核苷酸重復(fù)中，CCG／CGG重復(fù)基元占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，鱗翅目昆蟲(chóng)二點(diǎn)委夜蛾中（CGC)n和（GCC)n的數(shù)量最多［24］;而在扶桑綿粉蚧［19］、黃粉蟲(chóng)［21］和 德 國(guó) 小 蠊 （Blattellagermanica（Linnaeus))［27］中 AAT／ATT 是優(yōu)勢(shì)基元;云南切梢小蠹［22］中AAT／ATT和ATC／GAT含量最多;在桔小實(shí)蠅［8］中，AGC／GCT 最常見(jiàn);在灰飛虱［24］中AAC／GTT數(shù)量最豐富;在褐飛虱［11］中 AAG／CTT占主導(dǎo)地位，而CCG／CGG的含量卻是最低的，僅占褐飛虱三核苷酸重復(fù)基元的1.83%。

值得注意的是，粘蟲(chóng)二核苷酸重復(fù)基元中GC／GC所占的比例達(dá)到25.7%，僅僅低于重復(fù)基元AC／GT。該結(jié)果與鱗翅目昆蟲(chóng)二點(diǎn)委夜蛾［13］和細(xì)梢小卷蛾［14］中GC／GC重復(fù)基元很常見(jiàn)相類(lèi)似。以往對(duì)昆蟲(chóng)EST-SSR的研究中，GC／GC的含量都極低甚至沒(méi)有。例如在灰飛虱［24］和褐飛虱［12］EST-SSR搜索中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GC重復(fù)基元;在桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組SSR中含有3個(gè)GC／GC重復(fù)基元［8］，云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組中僅有2個(gè)［22］。粘蟲(chóng)、二點(diǎn)委夜蛾和細(xì)梢小卷蛾同屬鱗翅目，GC／GC重復(fù)基元是否與鱗翅目的某些特殊功能有關(guān)系，今后需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究基于粘蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘獲得大批量SSR，并對(duì)SSR數(shù)量分布相關(guān)特性及可用性進(jìn)行了闡述和評(píng)估，表明通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘SSR的方法是高效可行的。研究結(jié)果為粘蟲(chóng)遺傳圖譜的構(gòu)建、種群多樣性分析以及特定基因的定位奠定了基礎(chǔ)，這對(duì)于探究粘蟲(chóng)擴(kuò)散、遷飛和交配等行為的分子機(jī)制以及粘蟲(chóng)的綜合防治都具有重要意義。同時(shí)，也為鱗翅目其它種類(lèi)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘SSR提供參考。

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The Information Analysis of SSR Loci in theMythimnaseparate（Walker)Transcriptome

Hu Yanhua1，Li Min1，2，Zhang Hufang1＊，Li Shengcai1，Wang Qing2，Zhao Huiling2
（1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.DepartmentofBiology，TaiyuanNormalUniversity，TaiyuanShanxi030031，China)

Mythimnaseparata（Walker)is a kind of migratory pests and causes serious damage to the crops such as corn，wheat，rice and so on.Simple sequence repeat（SSR)is tandemly repeated motif of 1～6nucleotide.The information analysis of SSR loci in theMythimnaseparate（Walker)establishes a theoretical basis for the research of molecular mechanisms such as its diffusion，journey and mating behavior，as well as its integrated control.Based on the constructed transcriptome database inMythimnaseparata，the SSR loci were explored by the software msatcommander.In total，400SSR loci were explored from 20 776transcriptome unigenes，and they were distributed in 372unigenes.Among these SSR loci，trinucleotide were the most abundant repeats，of which were 271，followed by dinucleotide and mononucleotide repeats，of which were 70and 49，respectively.Tetra-、penta-and hexanucleotide were 10in all.There were 24 kinds of repeated motif types inMythimnaseparatatranscriptome SSR.CCG／CGG was the most advantages repeat motif types（69)，then AAG／CTT （57).There were 18CG／CG repeated motif types which accounted for 25.3%of the dinucleotide repeat motif types.The SSR loci which were discovered in this study would benefit a lot for the construction of gene mapping，the research of genetic diversity and the parentage analysis.

Mythimnaseparata;Transcriptome;SSR;Repeat type;Motif type

S433.4

A

1671-8151（2015)05-0484-06

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.007

2015-04-12

2015-05-21

胡艷華（1990-)，女（漢)，山西洪洞人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治

＊通訊作者：張虎芳，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：0354- 6288225;E-mail：zh＿h(yuǎn)ufang＠sohu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（31440078);中國(guó)博士后研究經(jīng)費(fèi)（134845);山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2014376);太原師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（20140413)

（編輯：武英耀)