楊陽，亢秀萍

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系 ，山西 呂梁 033000;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

耬斗菜花芽分化及發(fā)育的初步研究

楊陽1，亢秀萍2＊

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系 ，山西 呂梁 033000;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

試驗采用常規(guī)實體解剖石蠟切片法，顯微觀察耬斗菜低溫春化后花芽分化及發(fā)育的過程。結(jié)果表明：耬斗菜植株在結(jié)束低溫春化處理自然條件下生長15～20d，莖端分生組織開始向花序分生組織轉(zhuǎn)化;20d左右，頂生花花分生組織兩側(cè)對稱出現(xiàn)萼片原基;20～30d頂生花花分生組織高度隆起，兩側(cè)基部對稱向外生出雄蕊原基;自然條件下生長30d，雌蕊原基開始分化，隨即在雌蕊原基邊緣形成數(shù)個突起，突起逐漸長大成為心皮原基。

耬斗菜;低溫春化;花芽分化

耬斗菜于（AquilegiavulgarisL.)毛茛科耬斗菜屬。原產(chǎn)于歐洲、西伯利亞，自然分布于北半球溫帶，大約有70～120種。耬斗菜為多年生草本，基生葉2～3回三出復(fù)葉。單歧或二歧聚傘花序，萼片5枚花瓣狀，花瓣與萼片近等大，同色或異色，下延成距，距直或末端彎曲呈鉤狀，稀呈囊狀或無距。雄蕊多數(shù)，內(nèi)輪常退化而無花藥，白色膜質(zhì)。雌蕊由5～10個離生心皮組成，胚珠多數(shù)。

毛茛科植物大多保持著離生的雄蕊和雌蕊螺旋狀排列在膨大花托上的特點，Corner曾發(fā)現(xiàn)毛茛科耬斗菜屬的離生雄蕊群屬于向心發(fā)育式樣。Kosuge等在Aquilegia buergeriana花瓣個體發(fā)育研究中，發(fā)現(xiàn)其雄蕊群花絲伸長的順序是離心的。傅德志等在耬斗菜屬花部形態(tài)發(fā)生的研究中指出對耬斗菜花芽分化及發(fā)育過程的研究，特別是雄蕊群原基的發(fā)生順序與雄蕊的發(fā)育過程，對于揭示雄蕊群離心發(fā)育的形態(tài)學(xué)本質(zhì)有著重要的意義［1］。我國有豐富而珍貴的耬斗菜野生質(zhì)資源，特別是山西有豐富的華北耬斗菜資源，掌握耬斗菜的開花習(xí)性，花芽分化及發(fā)育過程，對今后的新品種選育，種子、種苗、盆花和鮮切花的規(guī)模化生產(chǎn)意義重大。

1 材料與方法

AquilegiaCaerulea（大花耬斗菜天鵝系列)。試驗對15片葉齡的耬斗菜植株進行35d的低溫處理，并對花芽分化進程跟蹤觀察。

低溫春化處理35d結(jié)束后，將0d（對照)和35 d處理植株放置在日均溫20℃的自然條件下生長。每5日取材一次，每次隨機取樣5株。剝?nèi)ネ鈱由徸~，露出小葉包裹的莖尖，立即放于FAA固定液中固定并保存。常規(guī)石蠟切片，采用番紅－固綠雙重染色法。固定－脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－粘片－脫蠟－番紅、固綠染色－封藏－鏡檢拍照。切片厚度為7.5μm，加拿大中性樹膠封片。

耬斗菜莖尖石蠟切片制片染色觀察的具體方法：

（1)取材、固定。剝?nèi)ネ鈱由徸~，露出葉鞘包裹的莖尖，放入FAA固定液中固定，用針管抽氣，使材料沉底，使固定液充分進入組織，可長期保存。貼標簽注明取材日期。

（2)脫水、透明。按乙醇濃度梯度為（50%、70%、80%、95%、100%、100%)，1／2 100%乙醇＋1／2二甲苯，二甲苯兩次的順序脫水、透明。同時為了使材料充分脫水，分別在80%乙醇和1／2 100%乙醇＋1／2二甲苯中過夜。1／2 100%乙醇＋1／2二甲苯混合液中加入少許番紅粉末，以便以后切片中材料與石蠟容易辨別。

（3)浸蠟、包埋。材料從二甲苯Ⅱ中取出放入1／2二甲苯＋1／2石蠟混合液中放入36℃烘箱2h后，將烘箱調(diào)至40℃過夜。次日烘箱調(diào)至52～62℃保持2h，浸蠟。然后用紙盒常規(guī)包埋。

（4)切片、粘片、展片、烘片。修正蠟塊，將其固定在小木塊上。調(diào)整好切片機進行切片，切片厚度7.5μm。選擇干凈的載玻片，滴一滴粘片劑并用手指抹開，選擇蠟帶光面朝下黏貼在載玻片上。滴展片劑數(shù)滴后放在40℃左右的水浴鍋上展片。（水浴鍋水面鋪平保鮮膜，載玻片放在上面展片效果更好)。最后放入40℃烘箱中烘片，48h最佳。

（5)脫蠟、染色、封片、觀察。切片先經(jīng)二甲苯兩次、1／2 100%乙 醇 ＋1／2 二 甲 苯、乙 醇（100%、100%、95%、85%、70%、50%)、蒸餾水的順序逐級脫蠟，復(fù)水。然后用番紅溶液染色24h。再經(jīng)蒸餾水、1%HCl溶液、乙醇（50%、70%、80%)、固綠溶液復(fù)染，100%乙醇、1／2 100%乙醇＋1／2二甲苯、二甲苯順序分色，透明。完成上述過程后用加拿大中性樹膠封片。

（6)觀察、拍照、分析。

2 結(jié)果與分析

對照組未經(jīng)過低溫處理，耬斗菜植株不進行花序原基分化;在低溫處理階段，花序原基并不發(fā)生，只有將植株轉(zhuǎn)移到適宜的環(huán)境條件下，營養(yǎng)莖端分生組織才向花序分生組織轉(zhuǎn)化。完成成花誘導(dǎo)的耬斗菜植株在適宜的環(huán)境條件下生長就會進入花芽分化階段，未完成成花誘導(dǎo)的植株則不會進入花芽分化階段。研究發(fā)現(xiàn)，耬斗菜花芽分化分為未分化期、分化始期和花器官形成期。

2.1 未分化期

即營養(yǎng)莖端分生組織分化期（圖1)：低溫處理結(jié)束后耬斗菜植株的莖端分生組織均處于營養(yǎng)莖端分生組織階段。此時的莖尖生長錐被最小的葉片原基包裹，莖端分生組織的原套－原體結(jié)構(gòu)成三角錐狀略有隆起，兩側(cè)對稱分化兩個互生葉原基。

圖1 營養(yǎng)莖端分生組織分化期Fig.1 Predifferentiation Stage

2.2 分化始期

即花序分生組織分化始期（圖2)：耬斗菜植株在結(jié)束35d的低溫春化處理自然條件下生長15～20d后，莖端分生組織開始向花序分生組織轉(zhuǎn)化。此時莖端分生組織停止分化基生蓮座葉的葉原基，其三角錐狀突起的頂端開始變寬平，分生組織右側(cè)出現(xiàn)突起。

2.3 花器官形成期

（1)花被分化期：此分化期可分為花萼分化和花瓣分化。花萼分化期（圖3)：低溫春化處理的耬斗菜植株自然條件下生長20d左右，頂生花花分生組織兩側(cè)對稱出現(xiàn)兩個較大的突起即萼片原基。萼片原基進一步發(fā)育形成萼片。萼片原基外側(cè)是兩枚莖生葉的葉原基和由花序分生組織分化的側(cè)花序原基。在花萼原基形成后，在萼片內(nèi)側(cè)花分生組織基部產(chǎn)生突起即花瓣原基?；ò暝▓D4)進一步發(fā)育形成花瓣。

圖2 花序分生組織分化始期Fig.2 Initial stage of flower buds

圖3 花萼分化期Fig.3 Sepal Primordial

（2)雄蕊分化期（圖5)：低溫春化處理的耬斗菜植株自然條件下生長20～30d，頂生花花分生組織的原套－原體結(jié)構(gòu)高度隆起，兩側(cè)基部對稱向外生出突起即雄蕊原基。雄蕊群原基發(fā)生的順序是由基部向頂端螺旋狀進行。即基部雄蕊原基最早發(fā)生，發(fā)生方式是螺旋狀依次向頂端發(fā)生出其它雄蕊原基;雄蕊原基的大小基部最大依次直至頂端雄蕊原基逐漸變小，雄蕊發(fā)育過程花藥的發(fā)育早于花絲的發(fā)育;退化雄蕊出現(xiàn)在雄蕊群頂部最內(nèi)層，其花絲結(jié)構(gòu)不完整，膜質(zhì)化。

圖5 雄蕊分化期Fig.5 Stamens primordial differentiation stage

圖6 雌蕊分化期Fig.6 Pistils primordial differentitiation stage

（3)雌蕊分化期（圖6)：低溫春化處理的耬斗菜植株自然條件下生長30d，待花芽中的雄蕊原基全部形成后，花分生組織頂端漸漸變平坦，隨即在雌蕊原基邊緣形成數(shù)個突起，突起逐漸長大成為心皮原基。

待耬斗菜能肉眼判斷抽薹（低溫處理后40d左右)時，對頂花芽進行石蠟切片觀察，這時雌蕊心皮內(nèi)壁向內(nèi)產(chǎn)生突起，這些突起隨著植株生長，發(fā)育成胚珠（圖7)。切片觀察發(fā)現(xiàn)，心皮兩側(cè)胎座對稱形成胚珠。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過石蠟切片對完成成花誘導(dǎo)的耬斗菜植株莖端分生組織顯微觀察，研究發(fā)現(xiàn)并證實了在低溫下，花序原基并不發(fā)生，只有將植物轉(zhuǎn)移到適宜的環(huán)境條件下，營養(yǎng)莖端分生組織才向花序分生組織轉(zhuǎn)化，即低溫只起誘導(dǎo)作用。

圖7 胚珠形成期Fig.7 Ovary wall and ovule

耬斗菜莖端分生組織在不同的發(fā)育階段產(chǎn)生不同的器官，發(fā)育早期，莖端分生組織形成蓮座狀基生葉，此時的莖端分生組織為營養(yǎng)莖端分生組織。但當植株向開花過渡時，莖端分生組織轉(zhuǎn)化成初生花序分生組織，后者可直接產(chǎn)生花芽。此后葉原基產(chǎn)生一些莖出葉，在莖出葉葉腋下在形成次級花序分生組織。在花序分生組織形成后，再特化為花分生組織。因此在從營養(yǎng)生長往生殖生長過渡的進程中，經(jīng)歷了營養(yǎng)莖端分生組織——花序分生組織——花分生組織——花器官形成4個階段。

耬斗菜是單歧或二歧聚傘花序，頂生花發(fā)生先于側(cè)生花序，切片觀察結(jié)果當頂生花分生組織分化萼片原基時，側(cè)生花序分生組織略微隆起，當頂生花進入雄蕊分化期時，側(cè)生花分生組織才高度呈球型隆起。切片同時觀察到，當頂生花開始進入雄蕊分化期后，花莖高度隨之增加。試驗中觀察到花萼分化期開始后很快就開始花瓣分化期，兩個時期幾乎是同時發(fā)生，依次發(fā)育。

耬斗菜雄蕊群在原基發(fā)生階段為向心發(fā)生，如圖5、圖6，雄蕊群在原基早期發(fā)生是由外向中心發(fā)育，及所謂的向心發(fā)生。在其后的發(fā)育過程，最內(nèi)側(cè)的雄蕊原基發(fā)育強烈，最后形成退化雄蕊，圖7可觀察到。而有最內(nèi)輪退化雄蕊原基發(fā)育引發(fā)的雄蕊群離心式發(fā)育未能在本試驗中充分證明。

［1］傅德志，梁漢興，路安民，等.耬斗菜屬花部形態(tài)發(fā)生［J］.植物學(xué)報，1995，37（10)：791-794.

［2］予茜，郭友好，黃雙全.三種耬斗菜屬植物柱頭的特征［J］.植物分類學(xué)報，2005，43（6)：513-516.

［3］Billie Gould，Elena M Kramer.Virus-induced gene silencing as a tool for functional analyses in the emerging model plantAquilegia（columbine，Ranunculaceae)［J］.Plant Methods，2007（3)：6.

［4］郭蕊，趙祥云，王文和，等.百合花芽分化的形態(tài)學(xué)觀察［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（1)：31-34.

［5］李曉梅.大豆莖頂端分生組織石蠟切片的制備［J］.大豆科學(xué)，2008，27（4)：708-710.

［6］徐青.植物石蠟切片雙重染色技術(shù)的改進［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1999，20（2)：89-90.

［7］郭麗榮.植物組織制片的研究方法［J］.中學(xué)生物學(xué)，2004，2：36-37.

［8］王金平，張俊梅.白頭翁花的石蠟切片制作［J］.信陽師范學(xué)院學(xué)報，2008，21（4)：573-576.

［9］鄭燕璇，王曉鴻，茍新敏.石蠟切片脫蠟方式的比較［J］.中國實用醫(yī)藥，2009，4（l4)：211-212.

［10］陳丹，陳進明，王勇，等.寬葉澤苔草的花器官發(fā)生［J］.植物分類學(xué)報，2003，41（3)：229-234.

Preliminary Study of the Flower Bud Differentiation and Development of theAquilegiaL.

Yang Yang1，Kang Xiuping2＊
（1.LifeScienceLvliangUniversity，LvliangShanxi033000，China;2.CollegeofHorticulture，ShanxiAgricultural University，TaiguShanxi030801，China)

Test by routine dissection of paraffin sectioning，flower bud differentiation and development ofAquilegiaafter low temperature vernalization was observed by the microtechnique.The results showed that：the stem apical meristem of theAquilegiabegan to transform to inflorescence meristem after 15～20days low-temperature vernalization under natural condition.about 20d，sepal primordia symmetrically appeared bilaterally the apical meristem.20～30days，the apical meristem uplifted，staminate primodium symmetrically grew on both sides of the base;after 30dunder natural conditions，pistil primordia began to differentiate，then several protuberance formed on the edge of the pistillate primodium，and became a carpel primordia.

Aquilegia;Vernalization under low temperature;Flower bud differentiation

S682.21

A

1671-8151（2015)05-0474-05

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.005

2015-01-12

2015-03-25

楊陽（1983-)，女（漢)，甘肅蘭州人，碩士，研究方向：觀賞植物引種馴化及開花生理

＊通訊作者：亢秀萍，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel： 15803588106;E-mail：xingguoming＠163.com

（編輯：馬榮博)