王丹 ，姚曉東，李新鳳，王美琴，郝曉娟，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

山西晉城馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定

王丹 ，姚曉東，李新鳳，王美琴，郝曉娟＊，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

為分離鑒定山西晉城馬鈴薯瘡痂病病原菌，對(duì)分離物進(jìn)行致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定及16S rDNA序列分析。結(jié)果表明，該分離物在燕麥培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，邊緣稍有褶皺突起，顯微觀察孢子呈灰色，孢子鏈呈螺旋狀，結(jié)合生理生化特性測(cè)定結(jié)果將其鑒定為Streptomycesscabies。該菌株與Streptomycesscabies（登錄號(hào)為HM018114)的16SrDNA序列同源性為100%。引起山西晉城馬鈴薯瘡痂病的病原菌為Streptomycesscabies。

馬鈴薯瘡痂病;病原菌鑒定;鏈霉菌;16SrDNA序列

作為全球四大糧食作物之一［1］，馬鈴薯具有較高的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值，在人們消費(fèi)結(jié)構(gòu)中的地位越來(lái)越重要［2］。但其易被多種病原菌感染，影響地上及地下組織器官正常生長(zhǎng)。由鏈霉菌屬引起的馬鈴薯瘡痂病（potato scab)在各種植區(qū)發(fā)生普遍［3］，對(duì)馬鈴薯品質(zhì)及市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值造成了嚴(yán)重影響［4］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)引起該病害的病原菌種類(lèi)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)引起馬鈴薯瘡痂病病原菌種類(lèi)因不同國(guó)家和地區(qū)而異，具有明顯的區(qū)域特性和遺傳多樣性［5～7］。法 國(guó) 已 報(bào) 道 病 原 菌 主 要 是Streptomyces.reticuliscabiei、S.steliiscabiei［7］;在芬蘭發(fā)現(xiàn)的瘡痂病原菌有S.turgidiscabies、S.aureo-faciens、S.scabies等［8］;在加拿大東部地區(qū)，主要的瘡痂病病原為S.scabies、S.acidiscabies［9］;S.luridiscabiei、S.niveiscabiei、S.puniciscabiei等在韓國(guó)被報(bào)道［10，11］。張 萌［6，12，13］等 對(duì) 來(lái) 自 中 國(guó) 不 同 地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析和區(qū)域分布特性研究，結(jié)果表明S.bobili和S.galilaeus主要分布于內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北、山西等省，S.curopacisabiei和S.scabies主要分布于河北、黑龍江等省，在云南、四川等省發(fā)現(xiàn)了S.scabies，來(lái)自山東的瘡痂病原有S.diastato-chromogenes、S.acidiscabies、S.setonii等。目 前 對(duì) 山 西省馬鈴薯瘡痂病病原菌種類(lèi)的報(bào)道較少。為明確山西晉城馬鈴薯瘡痂病原菌種類(lèi)，本試驗(yàn)對(duì)從該地區(qū)采集到的馬鈴薯瘡痂病病薯進(jìn)行了病原菌的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 病薯癥狀觀察及病原菌的分離

2014年5月從山西晉城馬鈴薯種植區(qū)采集馬鈴薯瘡痂病病薯，對(duì)其癥狀進(jìn)行觀察。

將病薯塊莖帶回實(shí)驗(yàn)室用蒸餾水清洗，經(jīng)3%的NaClO溶液進(jìn)行表面消毒后用無(wú)菌水清洗，晾干。向無(wú)菌研缽中加20mL 1∶140的苯酚溶液，取小塊病健交界處組織于研缽中研碎，浸泡10min，取20μL涂在大豆葡萄糖瓊膠平板上（大豆粉5.0g，葡萄糖5.0g，CaCO30.4g，瓊脂粉17.0g，蒸餾水1 000mL，pH8.0)，于30℃恒溫培養(yǎng)5d［14］。挑取單菌落于燕麥培養(yǎng)基（燕麥片20g，瓊脂粉18g，蒸餾水1 000mL，pH7.2)上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，經(jīng)3次純化培養(yǎng)后刮取培養(yǎng)7d的孢子配成懸浮液，20%甘油－20℃保存。

1.2 致病性測(cè)定

采用 Tuber slice assays法［15］，選取健康馬鈴薯，經(jīng)0.5%的NaClO溶液表面消毒和無(wú)菌水清洗后晾干，用15mm的打孔器從馬鈴薯的中心打取接種組織，將圓柱形接種組織切成厚度為3mm的圓片，置于含有三層無(wú)菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，用6mm的打孔器打取經(jīng)OMA培養(yǎng)基培養(yǎng)7d的待測(cè)菌的菌餅，接種于馬鈴薯薄片中心，以空白菌餅作為對(duì)照。于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，分別于7d、14d時(shí)觀察病斑情況。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

挑取在燕麥培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)7d的菌落于載玻片上，100倍光學(xué)顯微鏡下觀察孢子及孢子鏈特征［16］。

1.4 生理生化特性測(cè)定

參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［17］和鏈霉菌鑒定手冊(cè)［18］中測(cè)定方法，對(duì)該菌株進(jìn)行碳源利用、氮源利用、黑色素產(chǎn)生、硫化氫產(chǎn)生、淀粉利用和敏感性等方面測(cè)定。

1.5 16S rDNA序列擴(kuò)增及同源性分析

1.5.1 基因組的提取

參考劉炳輝［19］等優(yōu)化SDS法來(lái)提取該菌株基因組DNA。

1.5.2 16SrDNA PCR擴(kuò)增

選取16SrDNA通用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物（Primer)序列：

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s;55℃退火30s;72℃延伸90s;共32個(gè)循環(huán)。72℃最后延伸10min，4℃保存。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。得到的拼接序列在NCBI作BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病薯癥狀描述

病原菌侵染造成馬鈴薯塊莖病部表皮粗糙，有裂縫。病斑組織木栓化、壞死，表面呈棕褐色凸起瘡痂（圖1-A)。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

采用小薯片法對(duì)代表菌株JC-1進(jìn)行致病性測(cè)定，接種7d后，該菌株可在接種體上擴(kuò)展生長(zhǎng)，菌餅周?chē)捎^察到輕微褐變;14d后，可觀察到明顯褐變和壞死。

2.3 病原菌形態(tài)特征

JC-1菌株在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈灰白色，邊緣稍有褶皺突起（圖1-B)。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子呈灰色，孢子鏈呈螺旋狀（圖1-C)。

圖1 病害癥狀及病原菌形態(tài)觀察Fig.1 Symptoms of potato scab and morphological characteristic of isolated strain

2.4 生理生化特性測(cè)定結(jié)果

JC-1菌株能夠以果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、棉籽糖、肌醇等碳源為單一碳源。能以甲硫氨酸、組氨酸為單一氮源。對(duì)鏈霉素、青霉素、結(jié)晶紫均敏感。能使ISP6培養(yǎng)基變黑，表明可產(chǎn)生黑色素。能使Tresner培養(yǎng)基變黑，證明可產(chǎn)生H2S?？僧a(chǎn)生淀粉水解酶。符合Streptomycesscabies生理生化特性（表1)。

2.5 16S rDNA序列分析結(jié)果

擴(kuò)增得到分子量約1 500bp的16SrDNA片段（圖2)。在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，在以Actinomycesnaturae（登錄號(hào)為FJ234421)為外群，使用MEGA5.05軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中（圖3)，待測(cè)菌株JC-1與Streptomycesscabies（登錄號(hào)為HM018114)同源性為100%。16SrDNA序列分析證明該菌株為Streptomycesscabies，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

表1 馬鈴薯瘡痂病菌JC-1生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the pathogen of potato scab

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯的重要病害之一，給馬鈴薯的品質(zhì)造成極大影響，通常使馬鈴薯減產(chǎn)10%～30%［20］。本研究從病原菌的培養(yǎng)物特征、顯微形態(tài)、生理生化特性等方面進(jìn)行生物學(xué)研究，并結(jié)合16SrDNA序列分析，將山西晉城地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定為瘡痂鏈霉菌Streptomyces scabies。

圖2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果（M：Marker;1：JC-1菌株基因組擴(kuò)增產(chǎn)物)Fig.2 The results of PCR amplification for 16SrDNA sequences（M：Marker;1：PCR products of the strain JC-1)

圖3 基于16SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of the scab-related strain

山西馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在促進(jìn)山西經(jīng)濟(jì)發(fā)展，農(nóng)民收入增加方面有重要意義，本研究采集的病薯來(lái)自于晉城，今后還應(yīng)進(jìn)一步調(diào)查山西省不同馬鈴薯種植地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的情況，采集并進(jìn)行病原菌分離鑒定，為有效防治該病害以及探究馬鈴薯瘡痂病菌遺傳多樣性提供可靠依據(jù)。

［1］康蓉，王生榮.甘肅馬鈴薯瘡痂病病原初步鑒定［J］.植物保護(hù)，2013，39（3)：78-82.

［2］張軟斌.山西馬鈴薯可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)業(yè)研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

［3］V.Sedláková，J.Dejmalová，P.Dolezal，et al.Characterization of forty-four potato varieties for resistance to common scab，black scurf and silver scurf［J］.Crop Protection，2013，48：82-87.

［4］陳俊林，趙偉全，于秀梅，等.馬鈴薯瘡痂病新致病種StreptomycesgalilaeusCPS-2轉(zhuǎn)化體系的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（8)：71-75.

［5］趙偉全，楊文香，李亞寧，等.中國(guó)馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（2)：313-318.

［6］張萌，趙偉全，于秀梅，等.中國(guó)馬鈴薯瘡痂病病原菌16SrDNA的遺傳多樣性分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（2)：499-504.

［7］Bouchek-Mechiche K，Gardan L，Normand P，et al.DNA relatedness among strains ofstreptomycespathogenic to potato in France：description of three speciesStreptomyceseuropaeiscabieisp.nov.andStreptomycessteliiscabieisp.nov.associated with common scab，and-Streptomycesreticuliscabeisp.Nov.associated with netted scab［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50：91-99.

［8］P.Lindholm，H.Kortemaa，M.Kokkola，et al.Streptomycesspp.isolated from potato scab lesions under nordic conditions in Finland［J］.Plant Disease，1997，81：1317-1322.

［9］Rene′e St-Onge，Claudia Goyer，Robert Coffin，et al.Genetic diversity ofStreptomycesspp.Causing common scab of potato in eastern Canada［J］.Systematic and Applied Microbiology，2008，31：474-484.

［10］Jeak Yeong Song，Seong Chan Lee，Jun Won Kang，et al.Phylogenetic analysis ofStreptomycesspp.isolated from potato scab lesions in Korea on the basis of 16SrDNA gene and 16S-23SrDNA internally transcribed spacer sequences［J］.International Journal Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54：203-209.

［11］Duck Hwan Park，Yong Man Yu，Jeom Soon Kim，et al.Characterization of Streptomycetes causing potato common scab in Korea［J］.Plant Disease，2003，87：1290-1296.

［12］張萌.中國(guó)不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病菌遺傳多樣性分析［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［13］張萌，劉伯，于秀梅，等.中國(guó)馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（12)：2603-2610.

［14］方中達(dá).植病研究法［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：244-245.

［15］Rosemary Loria，Raghida A.Bukhalid，Robert，et al.Differential Production of Thaxtomins by PathogenicStreptomycesSpecies In Vitro［J］.Biochemistry and Cell Biology，1995，85（5)：537-541.

［16］杜娟，任娟，趙思峰，等.新疆馬鈴薯瘡痂病病原的鑒定［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版)，2010，28（4)：414-417.

［17］中國(guó)科學(xué)院微生物研究所伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)翻譯組.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：830-1207.

［18］中國(guó)科學(xué)院微生物所放線菌分類(lèi)組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1978：11-17，97-465.

［19］劉炳輝，曹遠(yuǎn)銀，閆建芳，等.6種鏈霉菌基因組 DNA提取方法比較［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（10)：86-89.

［20］張玉聚，李洪連，張振臣，等.中國(guó)蔬菜病蟲(chóng)害原色圖解［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2010：943-945.

Identification of The Pathogen of Potato Scab in Jincheng of Shanxi Province

Wang Dan，Yao Xiaodong，Li Xinfeng，Wang Meiqin，Hao Xiaojuan＊，Wang Jianming
（CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

The pathogen causing potato scab in Jincheng of Shanxi province was isolated and identified.The isolated strain from potato scab was analyzed and identified by pathogenicity identification，morphological observation，determination of physiological and biochemical characteristics and the analysis of 16SrDNA sequence.The colony of isolate was grey，which showing wrinkle and bulge on the edge of the colony.Conidium were grey and spore chains were spiral.According to morphological features and the charactersitics of physiology and biochemistry，the isolate was identified asStreptomycesscabies.The results of 16SrDNA sequences of the isolated strain showed 100%identity withStreptomycesscabies（HM018114).The results showed that the pathogen causing scab in Jincheng of Shanxi province wasStreptomycesscabies.

Potato scab;Pathogen identification;Streptomyces;16SrDNA sequence

S435.32

A

1671-8151（2015)05-0495-04

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.009

2015-03-30

2015-04-18

王丹（1988-)，女（漢)，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向：生物農(nóng)藥與生物防治

＊通訊作者：郝曉娟，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：0354- 6286806;E-mail：xiaojuanhao＠126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31000873);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中青年學(xué)術(shù)骨干基金（XG201210);山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311016-2)

（編輯：武英耀)