趙清，張佳慶，張虎芳

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津， 300071)

蝽類昆蟲干制標(biāo)本基因組提取及相關(guān)基因擴(kuò)增

趙清1，張佳慶2，張虎芳1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801;2.南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津， 300071)

本文以輝蝽（Carbulahumerigera)（半翅目：蝽科)為實驗材料，研究蝽科昆蟲干制標(biāo)本基因組的提取并擴(kuò)增相關(guān)基因。通過CTAB法、SA裂解法及吸附柱法，對50頭輝蝽干制標(biāo)本進(jìn)行了基因組提取試驗，并針對mtDNA的COI基因部分片段和nrDNA的ITS2基因部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得COI序列6條，ITS2序列33條。結(jié)果表明，核基因中的ITS2基因擴(kuò)增效果相對較好，而線粒體中的COI基因擴(kuò)增效果并不理想。通過對PCR產(chǎn)物電泳，結(jié)果顯示，1994－2008年的干制標(biāo)本，3種基因組提取方法均可行，且已獲得基因序列無明顯差別;1974－1989年的干制標(biāo)本，SA裂解法所造成的核酸損失大，提取效果不理想，而CTAB法、吸附柱法效果明顯。由于CTAB法耗時較長、對實驗材料需求量大、破壞較強(qiáng)且涉及如β－巰基乙醇等有毒試劑，SA法對基因組損失太大且雜質(zhì)保留較多，所以提取蝽科干制標(biāo)本及擴(kuò)增相關(guān)基因的最優(yōu)方法為二氧化硅膜吸附柱法。

干制標(biāo)本;基因提取;基因擴(kuò)增

半翅目蝽類昆蟲是昆蟲綱中一個較大的類群，全世界已知38 000余種［1］，其中包括很多有益類群和很多有害類群。近些年，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們對昆蟲的研究開始深入到了分子水平，尤其是在系統(tǒng)分類、分子系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化等方面［2，3］。在研究過程中一些稀有類群很難獲得新鮮材料，因此往往需要用博物館或標(biāo)本館的干制標(biāo)本提取基因組DNA，但干標(biāo)本保存時間越長基因組DNA的降解也越嚴(yán)重，提取效果就越不理想［4］。因此，從干標(biāo)本中有效的提取基因組DNA對昆蟲分子生物學(xué)研究至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所采用的標(biāo)本為均為南開大學(xué)昆蟲研究所分子系統(tǒng)學(xué)實驗室多年來積累的輝蝽干制標(biāo)本，分別采于2008（5頭)、2006（6頭)、2003（6頭)、2002（5頭)、2001（4 頭)、2000（6 頭)、1999（6 頭)、1994（3頭)、1989（3頭)、1986（3頭)、1974（3頭)（表1)。

PCR擴(kuò)增采用如下引物：

1.2 試驗方法

將干制標(biāo)本取一側(cè)足，將其浸泡于盛有TE的1.5mL離心管中，為防止標(biāo)本污染，在DNA擴(kuò)增前將其做一些預(yù)處理。本研究采用3種方法（1)CTAB法［5］、（2)二氧化硅膜吸附柱法（康為世紀(jì)CW0546)、（3)Chelex 100裂解液法（康為世紀(jì)CW0556)對同一年干制標(biāo)本mtDNA的COI基因片段及nrDNA的ITS2基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。證據(jù)標(biāo)本編號后，存放于南開大學(xué)昆蟲學(xué)標(biāo)本館。

PCR反應(yīng)采用50μL體系（表2)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置參照趙婉清等［6］文獻(xiàn)。經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有條帶的PCR產(chǎn)物送至金維智測序公司測序。獲得數(shù)據(jù)后，對序列進(jìn)行整理，所用方法參照趙清［7］文獻(xiàn)。

表1 實驗所用標(biāo)本詳細(xì)信息Table 1 Details of specimens investigated in the study

續(xù)表1

表2 使用Taqase酶的反應(yīng)體系（50μL)Table 2 The reaction composition using Takara Polymerase

2 結(jié)果與分析

本實驗以輝蝽（C.humerigera)干制標(biāo)本為實驗材料，通過CTAB法、SA法和吸附柱法進(jìn)行基因組提取，針對mtDNA的COI基因和nrDNA的ITS2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明COI基因擴(kuò)增不穩(wěn)定，50頭標(biāo)本僅擴(kuò)增出6條序列，序列長度為700bp，其中CTAB法有2008年和2003年擴(kuò)增成功，SA法有2008、2006、2003年擴(kuò)增成功，而二氧化硅膜吸附柱法僅有1994年擴(kuò)增成功。ITS2片段則穩(wěn)定許多，50頭標(biāo)本擴(kuò)增出33條序列，序列長度為833bp，從2008－1974年的實驗標(biāo)本均可以順利提取并擴(kuò)增出相應(yīng)片段，條帶明亮且重復(fù)性好，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果峰圖較好，沒有出現(xiàn)亂峰套峰的現(xiàn)象（圖2)。

由于材料有限，對干制標(biāo)本基因組提取目前只研究至1974年（40年前)。在提取2008－1994年的蝽類干制標(biāo)本時，在取材量相近的情況下，3種方法提取出的基因以模板量2μL擴(kuò)增的ITS2片段經(jīng)電泳后，紫外燈下觀察，其亮度并無明顯差別;對于1989、1986、1974年的標(biāo)本，取材均為兩條足，基因擴(kuò)增時模板量分為2μL、4μL、6μL，經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，CTAB法與吸附柱法所提基因量相近，SA法所提基因量比前2種方法要少些，PCR原液條帶明顯比其他2種方法暗（圖1)。

圖1 ITS2基因的PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of the ITS2gene

圖2 不同年份標(biāo)本的ITS2部分堿基序列峰圖（540～620bp)Fig.2 Trace files（electropherograms)showing the same fragment（between 540bp and 620bp)of the subunit ITS2in different years

3 結(jié)論與討論

近些年，對干制標(biāo)本基因組提取方法的研究越來越多［8～11］，但是針對半翅目蝽類昆蟲干制標(biāo)本基因提取及擴(kuò)增的研究較少，大多數(shù)是為了滿足實驗需要使用的零星干制標(biāo)本。如李紅梅等基于18SrDNA序列的蝽次目（半翅目：異翅亞目)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究中只是用了幾頭干制標(biāo)本，且沒有提及蝽科標(biāo)本的名稱及采集時間［12，13］;Damgaard＆Zettel關(guān)于水黽（異翅亞目：黽蝽科)遺傳多樣性等方面的研究中采用的少量標(biāo)本為干制標(biāo)本，其中最久遠(yuǎn)的實驗材料為10年前的標(biāo)本［14］;Hebsgaard等基于線粒體DNA 16SrRNA和核糖體28SrDNA序列及形態(tài)學(xué)的水生蝽類昆蟲（半翅目－異翅亞目：蝎蝽次目)的研究中，年代最久遠(yuǎn)的干制標(biāo)本采于1995年。

Lis等對干制標(biāo)本中線粒體基因組的提取做了較全面系統(tǒng)的研究，從5科48頭干制標(biāo)本中擴(kuò)增出線粒體DNA 16SrRNA和12SrRNA，并成功提取出了1894年的蝽類干制標(biāo)本基因［3］。但此研究中所擴(kuò)增序列長度僅為460bp，實驗步驟較繁瑣且對實驗材料需求量較大，常需要選取一個完整的蝽類標(biāo)本進(jìn)行浸泡處理，除去其前胸背板或頭部來挑取足量的胸部肌肉進(jìn)行實驗，所以會對標(biāo)本造成極大破壞，影響形態(tài)學(xué)研究。

提取基因組最傳統(tǒng)的方法為CTAB法，對提取干制標(biāo)本基因的效果較明顯，即便是近40年的標(biāo)本也可以很好地將線粒體DNA提取出來，但此過程涉及的有機(jī)試劑具有一定的毒性，如β－巰基乙醇，且裂解之后的操作步驟較為繁瑣，耗時較長，全過程需要一天的時間。另外，在抽提過程中容易造成較大程度的核酸損失，在洗滌沉淀時也存在一定的概率會將沉淀沖走，導(dǎo)致提取失敗。由于CTAB法對實驗材料需求量較大，取材時一般是將整頭輝蝽標(biāo)本進(jìn)行浸泡，并需通過除去輝蝽的前胸背板或頭部而取出其胸部肌肉進(jìn)行實驗，對標(biāo)本破壞較大，所以綜合來看，CTAB法并不是一個足夠安全且高效穩(wěn)定的提取干制標(biāo)本基因的方法，但其優(yōu)點(diǎn)是成本低。

本研究所采用的SA法在提取干制標(biāo)本基因組時方便快捷，且耗時短，只需5h即可完成，但其裂解組織的過程中對基因損耗較大，所以裂解時間不宜過長，以2.5h為宜。SA法對提取近20年的干制標(biāo)本基因效果很好，若年代再久遠(yuǎn)一些，則效果不明顯。另外，提取過程中對雜質(zhì)的保留較多，有時會影響后續(xù)PCR反應(yīng)，所以也不是最優(yōu)的提取方法。

二氧化硅膜吸附柱法實驗時間較CTAB法短很多，5h即可完成全部提取實驗，且所用的試劑對身體無毒害;同時其提取效果比較穩(wěn)定，對于40年前的干制標(biāo)本，要比SA裂解法提取效果好很多，且在抽提洗脫過程中要經(jīng)過多次過濾，能有效的除掉許多雜質(zhì)。綜合考慮，二氧化硅膜吸附柱法既兼具了SA裂解法和CTAB法的優(yōu)點(diǎn)，又有效的規(guī)避了他們在實驗過程中的明顯缺陷，是一個最優(yōu)的提取蝽類干制標(biāo)本基因的方法。

本研究中所擴(kuò)增的COI基因片段約700bp，且僅擴(kuò)增5條，分析其原因，可能為實驗所用的干制標(biāo)本，雖然保存在理想的環(huán)境中，但是由于年代久遠(yuǎn)，線粒體DNA已經(jīng)斷裂成小片段，所以本實驗所選用的引物未能擴(kuò)增出，亦或是實驗所用干制標(biāo)本已經(jīng)不含可以擴(kuò)增的內(nèi)源性線粒體DNA。當(dāng)擴(kuò)增ITS2基因時，無論是CTAB法、SA法還是吸附柱法結(jié)果均顯示能成功提取并擴(kuò)增，除了1989年、1986年和1974年略暗外，并無明顯差異。

綜上，可以得出：（1)吸附柱法綜合了CTAB法和SA法兩者的優(yōu)點(diǎn)，時間短，5h就可以完成提取基因組過程，所用試劑對身體無毒害，綜合考慮是最優(yōu)的提取基因組的方法。（2)當(dāng)干制標(biāo)本不能滿足實驗需求時，可以考慮干制標(biāo)本，無論是線粒體DNA還是核DNA都可以提取基因組的。但是當(dāng)干制標(biāo)本的線粒體DNA降解嚴(yán)重時，長片段很難擴(kuò)增，此時可以考慮擴(kuò)增一些短的片段（如100～200bp)，之后將短片段拼接成長片段。

本研究表明，蝽類干制標(biāo)本適合種群遺傳學(xué)研究，在很多情況下，取昆蟲一條足就可以提取核基因ITS2，同時我們可以改進(jìn)其他的試驗方法以獲取長片段的線粒體COI基因。本研究工作對蝽類昆蟲其他科或?qū)俚姆肿酉到y(tǒng)學(xué)及進(jìn)化研究具有重要意義，對于一些稀缺物種能夠充分利用標(biāo)本室積累的干制標(biāo)本，縮短研究時間，節(jié)省人力和物力。

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Extract DNA from Dry Specimens of Pentatomidae and Amplify the Related Genes

Zhao Qing1，Zhang Jiaqing2，Zhang Hufang1
（1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CollegeofLifeSciences，NankaiUniversity，Tianjin300071，China)

This paper tookCarbulahumerigera（Hemiptera：Pentatomidae)as main material to study DNA extraction from dried specimens and amplify the related genes.Fifty dried specimens collected from 1974to 2008were analyzed.CTAB，SA lysis and Silical coating column methods were all used to extract genes from one side legs of each specimen.The mitochondrial DNA （COIgene fragment)and the nuclear rDNA （ITS2gene fragment)were successfully amplified from six specimens and thirty-three specimens，respectively.The comparison of results demonstrates that all the three methods are feasible for the specimens from 1994to 2008and no obvious difference was found among the sequences from different methods.However，for the specimens as far back as 1974to 1989，the SA lysis method lost DNA a lot，while the other methods not.Since the CTAB method costs much time，destroys specimens a lot by peeling chest muscle and uses toxic organic solvents such as 2-mercaptoethanol，in SA method，the genome lost too much and the impurity contained a lot，so the Silical coating column method is turned out to be the best method of extracting DNA from dried specimens and amplifying the related genes.

Dried specimen;DNA extraction;Gene amplification

S433.3

A

1671-8151（2015)03-0478-05

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.006

2015-06-01

2015-06-25

趙清（1985-)，女（漢)，山東臨沂人，講師，博士，研究方向：DNA分類學(xué)。

張虎芳，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：0354- 6288225;E-mail：zh＿h(yuǎn)ufang＠sohu.com

國家自然基金（31440078)，山西省教育廳高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新基金（2014131)，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（2014017)

（編輯：馬榮博)