朱夢軍，肖暉，王雄，吳金虎

(武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060)

麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠腦垂體泌乳素表達(dá)及乳腺組織形態(tài)學(xué)的影響

朱夢軍，肖暉，王雄，吳金虎

(武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060)

目的 觀察麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠垂體泌乳素(PRL)表達(dá)及乳腺組織形態(tài)學(xué)的影響。方法 大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺制備高泌乳素血癥模型。60只大鼠分為正常對照組、模型對照組、溴隱亭組及麥芽提取物大、中和小劑量組。除正常對照組外，其他組進(jìn)行造模。溴隱亭組給予溴隱亭0.389 mg·kg-1·d-1；麥芽提取物小、中和大劑量組分別給予麥芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常對照組和模型對照組給予等容量純化水。大鼠在造模成功后，灌胃給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療給藥，每次2 mL，每日1次，連續(xù)30 d。對大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測大鼠垂體PRL mRNA的表達(dá)水平，以及采用免疫組化法觀察乳腺組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果 正常對照組，模型對照組，溴隱亭組，麥芽提取物大、中和小劑量組的PRL陽性細(xì)胞數(shù)量分別為(2.4±0.3)，(21.7±0.8)，(3.8±0.5)，(4.5±0.4)，(6.7±0.5)，(15.8±1.2)個，PRL mRNA表達(dá)水平分別為(0.31±0.02)，(1.58±0.06)，(0.45±0.04)，(0.49±0.03)，(0.61±0.04)，(0.95±0.09)。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞數(shù)量和PRL mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，同時乳腺組織出現(xiàn)增生。與模型對照組比較，麥芽提取物大、中劑量組大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞數(shù)量和PRL mRNA表達(dá)水平顯著減少(P<0.01)，而且乳腺增生明顯減輕。結(jié)論 麥芽提取物能有效治療高泌乳素血癥及抑制乳腺組織的增生，作用機(jī)制是其顯著降低高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL的表達(dá)。

麥芽提取物；高泌乳素血癥；垂體；泌乳素；乳腺組織

高泌乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)是由病理性、藥理性、生理及特發(fā)性因素引起泌乳素濃度增高(>25 ng·mL-1)的一種下丘腦-垂體疾病，臨床上以閉經(jīng)、月經(jīng)稀少、不孕及溢乳等癥狀常見[1]。在普通人群中HPRL的發(fā)生率為0.4%，而在生殖障礙的女性發(fā)病率為9%～17%，是嚴(yán)重危害女性健康的一種疾病[2]。目前治療HPRL藥物存在價格昂貴、不良反應(yīng)大等特點，患者依從性很差，很難堅持治療[3-4]。我國《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》《中華本草》等許多古醫(yī)籍和現(xiàn)代中藥學(xué)權(quán)威工具書均記載和認(rèn)同麥芽的回乳功效[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，麥芽提取物能顯著降低高泌乳素血癥大鼠血清催乳素(prolactin，PRL)的水平[7-9]，但是其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚。本研究在此基礎(chǔ)上，觀察麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL表達(dá)水平及乳腺組織形態(tài)學(xué)的影響，進(jìn)一步揭示其抗高泌乳素血癥的藥效作用及機(jī)制，為其深入研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級雌性未孕斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購于華中科技大學(xué)實驗動物中心，合格證號：No.42009800000584，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。實驗前動物置于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，室溫18～25 ℃，相對濕度55%～70%，黑暗和光照時間比12 h：12 h。

1.2 藥物及試劑 麥芽購自湖北清大藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地安徽亳州，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定為麥芽正品[禾本科植物大麥(HordeumVulgare.L)的成熟果實經(jīng)發(fā)芽干燥而得]，符合《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下的規(guī)定。甲磺酸溴隱亭：Novartis Pharma Schweiz AG生產(chǎn)，批號：10080。鹽酸甲氧氯普胺注射液(滅吐靈)：河南潤弘制藥股份有限公司，批號1308612。Trizol、RNA 酶抑制劑(上海麗臣生物科技有限公司，批號：0629546)，大鼠泌乳素基因引物和內(nèi)標(biāo)引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司設(shè)計，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR-Mix(武漢博士德生物科技有限公司，批號：55248812)，抗大鼠 PRL 抗體、ENVISION 試劑(美國 DAKO 公司，批號：13214679)，PRL酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，批號：201305443)。

1.3 麥芽提取物的制備 干燥麥芽藥材1 kg粉碎后，經(jīng)10倍量水煎煮，每次1.5 h，共2次，濾液經(jīng)減壓濃縮得到麥芽提取物408 g，產(chǎn)率為40.8%，于4 ℃冰箱下保存?zhèn)溆谩｛溠刻崛∥镆源篼溠繅A為其質(zhì)量控制指標(biāo)，其大麥芽堿含量不低于0.035%。

1.4 HPRL模型制備與分組給藥 在大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺注射液，劑量為50 mg·kg-1，每天9：00和16：00分別注射1次，連續(xù)5 d[10]。ELISA試劑盒檢測大鼠血清中PRL的含量，與正常大鼠比較，造模大鼠血清PRL含量顯著升高，證實HPRL模型制備成功。50只造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對照組，溴隱亭組，麥芽提取物大、中和小劑量組，以10只正常大鼠作對照。動物灌胃藥物劑量參照人服藥的劑量，采用體表面積法進(jìn)行換算而來。溴隱亭組給予溴隱亭0.389 mg·kg-1·d-1；麥芽提取物小、中和大劑量組分別給予麥芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常對照組和模型對照組給予等容量純化水。除正常對照組外，其他組進(jìn)行造模。大鼠在造模成功后，灌胃給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療，每次2 mL，每日1次，連續(xù)30 d。

1.5 大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞的計數(shù) 給藥30 d后，處死大鼠。摘除大鼠腦垂體，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，應(yīng)用免疫組化法檢測大鼠腦垂體組織中 PRL 的水平。石蠟切片脫蠟后，加 3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育 5 min，滴加大鼠來源的 PRL抗體(一抗)，室溫60 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗3 次，每次2 min，然后滴加 Envision試劑(含二抗、三抗)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 次，每次2 min，應(yīng)用 DAB 溶液顯色，純化水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。顯微鏡(×200 倍)下，對PRL 陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.6 大鼠腦垂體組織中PRL mRNA表達(dá)水平的分析 用Trizol抽提大鼠腦垂體組織總RNA，加入三氯甲烷0.25 mL，4 ℃，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，加入等體積異丙醇，混勻后靜置，離心棄上清液，用75%乙醇1 mL洗沉淀，離心棄上清液，室溫干燥。將 RNA 樣品及引物于PCR儀中，進(jìn)行模板 cDNA 的合成(RT反應(yīng))，RT 產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在70 V 恒壓電泳20 min，于UVP 計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定樣本灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參照，計算相對含量。

1.7 大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)檢查 乳腺組織經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后，顯微鏡下進(jìn)行觀察，包括小葉、腺泡增生情況，導(dǎo)管形狀及厚度，以及是否出現(xiàn)分泌物。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞數(shù)量分析 在200倍視野下，隨機(jī)計5個小格的PRL陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞平均計數(shù)顯著升高(F=20.146，P<0.01)；與模型對照組比較，溴隱亭組(F=16.227，P<0.01)、麥芽提取物大劑量組(F=14.131，P<0.01)和中劑量組(F=11.552，P<0.01)的PRL陽性細(xì)胞平均計數(shù)明顯減少。見表1。

表1 6組大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞數(shù)量測定值

Tab.1 Positive cell count of pituitary PRL in six groups of rats

±s

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P< 0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P< 0.01

2.2 RT-PCR檢測大鼠腦垂體組織PRL mRNA表達(dá)水平 PRL在各組大鼠垂體組織中均有表達(dá)，其中模型對照組的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，溴隱亭組、麥芽提取物大和中劑量組的表達(dá)水平明顯低于模型對照組，見圖1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體組織PRL mRNA表達(dá)水平顯著升高(F=14.536，P<0.01)；與模型對照組比較，溴隱亭組(F=12.473，P<0.01)，麥芽提取物大劑量組(F=10.662，P<0.01)和中劑量組(F=7.145，P<0.05)的PRL mRNA 表達(dá)水平明顯降低，見表2。

2.3 對乳腺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 顯微鏡下可見，正常對照組大鼠乳腺小葉、腺泡和導(dǎo)管無增生、擴(kuò)張，腺體數(shù)量少，無分泌物；模型對照組大鼠乳腺小葉、腺泡和導(dǎo)管嚴(yán)重增生，存在大量分泌物；溴隱亭組大鼠乳腺小葉、腺泡部分增生，導(dǎo)管輕度擴(kuò)張，可見分枝，腔內(nèi)有少許分泌物；麥芽提取物小劑量組大鼠乳腺小葉、腺泡和導(dǎo)管嚴(yán)重增生，仍存在許多分泌物；麥芽提取物大、中劑量組大鼠乳腺腺泡分布均勻，基本恢復(fù)正常，大多數(shù)導(dǎo)管細(xì)長，無分支和分泌物，見圖2。

3 討論

PRL是由位于腺垂體后側(cè)位的泌乳細(xì)胞所分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，由 199 個氨基酸殘基構(gòu)成的含3 個二硫鍵的單鏈蛋白，具有一個由4 個反向平行的α螺旋構(gòu)成的結(jié)構(gòu)[11]。各種因素引起腺垂體嗜酸性細(xì)胞分泌過多的PRL(>25 ng·mL-1)，則會引發(fā)一系列疾病，西醫(yī)稱為HPRL，其臨床表現(xiàn)有溢乳、閉經(jīng)、月經(jīng)稀少、不孕等[12]。

M.Marker；A.正常對照組；B.模型對照組；C.溴隱亭組；D.麥芽提取物小劑量組；E.麥芽提取物中劑量組；F.麥芽提取物大劑量組.

圖1 RT-PCR產(chǎn)物

M.Marker；A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.low-dose malt extract group；E：middle-dose malt extract group；F.high-dose malt extract group

Fig.1 RT-PCR products

表2 6組大鼠腦垂體組織PRL mRNA 表達(dá)水平

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

血清PRL濃度的增高會擾亂下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)合成和分泌受阻，并減弱垂體對GnRH的敏感性，導(dǎo)致促卵泡激素和黃體生成素分泌低下，進(jìn)而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡發(fā)育不良和黃體功能不足而致月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)和不孕等。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.溴隱亭組；D.麥芽提取物小劑量組；E.麥芽提取物中劑量組；F.麥芽提取物大劑量組

圖2 6組大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)病理圖片(HE，×200)

A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.high-dose malt extract group；E.middle-dose malt extract group；F.low-dose malt extract group

Fig.2 Histomorphology of mammery tissue in six groups of rats(HE，×200)

研究發(fā)現(xiàn)，PRL與正常乳腺上皮細(xì)胞的泌乳素受體結(jié)合，會產(chǎn)生一系列反應(yīng)，包括刺激α乳清蛋白的合成、尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換、乳腺細(xì)胞鈉離子(Na+)的轉(zhuǎn)換及脂肪酸的合成，刺激乳腺腺泡發(fā)育和促進(jìn)乳汁的生成和分泌[13]。泌乳素異常升高可進(jìn)一步刺激雌激素合成，或抑制孕激素的分泌和抑制促卵泡激素、黃體生成素分泌，從而使雌激素的相對含量及活性增高，導(dǎo)致雌二醇長期過度刺激乳腺組織，從而造成乳腺增生[14]。

文獻(xiàn)報道，麥芽提取物能顯著降低HPRL大鼠血清PRL的水平，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，麥芽提取物能顯著抑制HPRL大鼠腦垂體PRL陽性細(xì)胞的數(shù)量和PRL mRNA的表達(dá)；同時，觀察到HPRL大鼠乳腺組織增生較嚴(yán)重，而麥芽提取物能顯著抑制其乳腺組織的增生。該研究從分子水平上證實了麥芽抗HPRL的確切療效，并且揭示其發(fā)揮藥效的作用機(jī)制是抑制腦垂體PRL mRNA的表達(dá)。不過，今后的研究還應(yīng)深入探索麥芽中抗HPRL的活性成分及作用機(jī)制，為開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗HPRL藥物奠定基礎(chǔ)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.012

Effects of Malt Extract on Hypophysis Prolactin Expression and Morphology of Mammary Tissues in Hyperprolactinemia Rats

ZHU Mengjun, XIAO Hui, WANG Xiong, WU Jinhu

(DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effects of malt extract on prolactin expression and morphology of mammary tissue in hyperprolactinemia rats. Methods Metoclopramide hydrochloride was injected subcutaneously to establish hyperprolactinemia model.Sixty rats were divided into normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.Except normal control group, hyperprolactinemia model was established in the other groups.Bromocriptine (0.389 mg·kg-1·d-1) was given to bromocriptine group.Malt extract (7.98, 15.96 and 31.92 g·kg-1·d-1) was administered in low-dose, middle-dose and high-dose malt extract groups.Equal volume of purified water was given to normal control group and model control group.After 30 days of administration, PRL positive cell number of rat hypophysis was counted.RT-PCR was used to measure hypophysis PRL mRNA expression, and morphology of mammary tissues was observed by immunohistochemical method. Results PRL positive cell number was (2.4±0.3), (21.7±0.8), (3.8±0.5), (4.5±0.4), (6.7±0.5) and (15.8±1.2) in normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.PRL mRNA expression level was (0.31±0.02), (1.58±0.06), (0.45±0.04), (0.49±0.03), (0.61±0.04), and (0.95±0.09), respectively.As compared with normal control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group were increased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands appeared.As compared with model control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group was decreased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands was alleviated obviously. Conclusion Malt extract can effectively treat hyperprolactinemia and inhibit hyperplasia of mammary glands through significantly decreasing the expression of hypophysis prolactin in hyperprolactinemia rats.

Malt extract； Hyperprolactinemia； Hypophysis； Prolactin； Mammary tissue

2014-04-17

2014-07-21

朱夢軍(1965-)，男，湖北武漢人，藥師，學(xué)士，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：(0)15971479069，E-mail：zhumengjun133494@163.com。

吳金虎(1962-)，男，湖北十堰人，主任藥師，博士，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。電話：027-68894991，E-mail：546939322@qq.com。

R285.5

A

1004-0781(2015)08-1036-04