王?，|， 馬方婧， 劉 銘， 桑 偉， 張 巍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1病理科， 2乳腺科， 烏魯木齊 830054)

表阿霉素對乳腺癌細(xì)胞系的作用效應(yīng)

王?，|1， 馬方婧2， 劉 銘1， 桑 偉1， 張 巍1

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1病理科，2乳腺科， 烏魯木齊 830054)

目的 探討表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系的作用效應(yīng)。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測并分析表阿霉素作用于乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SKBR3、 MDA-MB-231及MDA-MB-468后免疫原性標(biāo)志物的表達(dá)以及不同乳腺癌細(xì)胞系死亡過程中免疫原性死亡的能力；采用CCK-8方法觀察表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖的抑制效應(yīng)。結(jié)果 (1)表阿霉素作用于各個乳腺癌細(xì)胞系24 h后，MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞系的增殖率明顯低于MCF-7細(xì)胞系的增殖率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )。(2)MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞系表阿霉素作用24h的IC50值明顯低于MCF-7與SKBR3細(xì)胞系。(3) 鈣網(wǎng)蛋白、HSP70隨著表阿霉素作用時間的增加而增加，24h后MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。SKBR3細(xì)胞系中鈣網(wǎng)蛋白、HSP70的表達(dá)則稍高于MCF-7細(xì)胞系(P>0.05)。結(jié)論 表阿霉素的作用效應(yīng)不僅包括細(xì)胞毒性作用，還潛在免疫原性死亡作用過程；激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞死亡過程中的免疫原性死亡作用較強(qiáng)。

表阿霉素； 乳腺癌； 免疫原性死亡

中國目前是世界乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一。近年來，中國乳腺癌發(fā)病率以3 %的速率遞增，乳腺癌已成為城市女性死亡之首,在全球其他國家，乳腺癌同樣是婦女死亡的重要誘因[1]?；瘜W(xué)治療(化療)是乳腺癌早期治療的基石，化療可以改善淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者的預(yù)后[2-3]。但化療往往存在嚴(yán)重的毒性反應(yīng)并且費(fèi)用昂貴，因此研究化療耐藥的預(yù)測因子有很重要的意義。以往認(rèn)為化療的主要作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡達(dá)到清除腫瘤的目的。蒽環(huán)類化療藥物(阿霉素)不僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡，而且可誘導(dǎo)處于死亡過程中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)或釋放一些標(biāo)志物，介導(dǎo)微環(huán)境等改變增強(qiáng)死亡中腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[4-6]。這些標(biāo)志物包括細(xì)胞膜上的鈣網(wǎng)蛋白( calreticulin，CRT) 、MHC I 類分子、分泌型的熱休克蛋白( heat shock proteins，HSPs)等[7]。具有這些特征的死亡細(xì)胞能被機(jī)體免疫細(xì)胞，特別是被樹突狀細(xì)胞( dentritic cells，DCs)所攝取，DCs作為功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠刺激初始型T細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊[8]。這類能被免疫系統(tǒng)識別并攻擊的死亡腫瘤細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡( immunogenic cell death)[9-11]。這些免疫效應(yīng)可能對化療療效有獨(dú)特的作用，通過研究化療中腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡機(jī)制可進(jìn)一步探索腫瘤傳統(tǒng)化療有機(jī)結(jié)合免疫治療的策略，還可能指導(dǎo)化療療效的預(yù)后評估。

免疫原性細(xì)胞死亡是化療的主要目的之一，免疫原性死亡可促進(jìn)免疫系統(tǒng)通過“旁路效應(yīng)”消除化療耐藥細(xì)胞及癌癥干細(xì)胞[12-13]。乳腺癌是一類異質(zhì)性腫瘤，不同分子分型對化療的敏感性不同，雖然目前相關(guān)的研究眾多，但是其機(jī)制尚未明確。表阿霉素是目前乳腺癌常用的蒽環(huán)類化療藥物之一，其導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞免疫原性死亡的研究尚未開展。本研究旨在探討表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系的作用效應(yīng)及誘導(dǎo)免疫原性死亡標(biāo)志物表達(dá)的能力。

1 材料與方法

1.1 抗體及主要試劑藻紅蛋白-結(jié)合鼠單克隆抗人鈣網(wǎng)蛋白抗體購自于R&D公司(IC3898P)，Alexa Fluor?488鼠單克隆 抗人Hsp70抗體購自于Biolegend公司(648004)，表阿霉素(Epirubicin) 購自于Sigma 公司(E9406)，活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所，胎牛血清、DMEM粉狀培養(yǎng)基及青霉素-鏈霉素雙抗均購自于美國Gibco公司。

1.2 人乳腺癌細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系MCF7、SKBR3、MDA-MB-231及MDA-MB-468 均購自于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection， ATCC)。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468的細(xì)胞特點為雌激素受體(ER)(-)、孕激素受體(PR)(-)、人表皮生長因子受體2(Her-2)(-)，稱為三陰性乳腺癌細(xì)胞系。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞特點為ER、PR(+)、Her-2(-)，SKBR3細(xì)胞特點為ER、PR(-)、Her-2(+)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將各細(xì)胞系均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素及100 mg/L鏈霉素的 DMEM完全培養(yǎng)液中。在37℃含5%CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，挑選對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8方法觀察表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系的抑制效應(yīng)收集對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于二氧化碳無菌培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞長滿70%～80%(即對數(shù)生長期)時，分別加入藥物濃度為172.42、115.52、94.83、86.21、77.59、68.97、60.35、51.73、43.11、34.48、22.93、17.24、11.55、8.62、5.69、4.31、2.88、2.15、1.44、1.078、0.720 μmol/L的表阿霉素。每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照組為含細(xì)胞不加藥物孔，不含細(xì)胞及不含藥物的完全培養(yǎng)基復(fù)孔為調(diào)零孔。表阿霉素干預(yù)24 h后，吸出舊培養(yǎng)基，每孔加入90 μL新培養(yǎng)基及10 μL CCK-8試劑，置于37℃含5%CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。檢測各孔在450 nm處的吸光度(optical density, OD)值，計算表阿霉素對不同細(xì)胞系增殖率的影響。計算公式如下：細(xì)胞活力百分百=(實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。由藥物濃度和相應(yīng)的增殖率通過GraPh Pad Prism 5.0擬合表阿霉素對細(xì)胞系生長增殖曲線，計算出表阿霉素在不同細(xì)胞系中24 h的IC50值(本實驗后續(xù)藥物濃度即用此IC50值)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測表阿霉素作用后不同細(xì)胞系鈣網(wǎng)蛋白及HSP70的表達(dá)收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×108個/L接種于5 mL培養(yǎng)瓶，每瓶約1.5×106個細(xì)胞，置于無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁后，分別加入PBS及表阿霉素，使表阿霉素的最終濃度為不同細(xì)胞系對應(yīng)的IC50濃度。24 h后，將貼壁細(xì)胞用5 mL含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，并用PBS沖洗2遍。重懸1×106個細(xì)胞于500 μL流式固定液中10 min，然后將10 μL的抗體分別加入500 μL細(xì)胞懸液中并在室溫狀態(tài)避光孵育30 min。最后以1 000 r/min離心10 min，用PBS清洗1次后置于流式細(xì)胞儀，于0、 6、12、 24 h采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同表阿霉素IC50值作用于相應(yīng)細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白及HSP70表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖率的影響不同濃度的表阿霉素作用于各個乳腺癌細(xì)胞系24h后，MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞系的增殖率明顯低于MCF-7細(xì)胞系的增殖率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SKBR3細(xì)胞系的增殖率低于MCF-7細(xì)胞系的增殖率，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MDA-MB-231、MDA-MB-468、SKBR3與MCF-7細(xì)胞系的表阿霉素IC50值分別為8.62、5.69、11.55和34.48μmol/L。MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系的表阿霉素IC50值明顯低于SKBR3與MCF-7細(xì)胞系(圖1)。

2.2 表阿霉素作用于不同乳腺癌細(xì)胞系不同時間鈣網(wǎng)蛋白、HSP70的表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白、HSP70隨著表阿霉素作用時間的增加而增加，MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞系中鈣網(wǎng)蛋白與HSP70的表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞系。SKBR3細(xì)胞系中鈣網(wǎng)蛋白與HSP70的表達(dá)則稍高于MCF-7細(xì)胞系(圖 2a～b)。

圖1 表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖的影響

2.3 表阿霉素作用于不同乳腺癌細(xì)胞系24 h鈣網(wǎng)蛋白及HSP70表達(dá)的比較MDA-MB-231、MDA-MB-468及SKBR3細(xì)胞系鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MDA-MB-231與MDA-MB-468細(xì)胞系HSP70的表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SKBR3細(xì)胞系HSP70的表達(dá)略高于MCF-7細(xì)胞系，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3a～b)。

a:MCF-7鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)b:SKBR3鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)c:MAB-MB-468鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)d:MAB-MB-231鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)

e:MCF-7HSP70表達(dá)f:SKBR3HSP70表達(dá)g:MAB-MB-468HSP70表達(dá)h:MAB-MB-231HSP70表達(dá)

圖2 表阿霉素作用于不同乳腺癌細(xì)胞系不同時間鈣網(wǎng)蛋白、HSP70的表達(dá)

a: 24 h后鈣網(wǎng)蛋白表達(dá) b: 24 h后HSP70表達(dá)

圖3 表阿霉素作用于不同乳腺癌細(xì)胞系24 h鈣網(wǎng)蛋白、HSP70的表達(dá)

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性惡性腫瘤。目前乳腺癌治療的首要目標(biāo)是促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，抑制癌細(xì)胞生長。最近研究表明細(xì)胞死亡具有一定的免疫原性，主要特點是在細(xì)胞膜上表達(dá)CRT、MHCI 類分子、HSPs及分泌型蛋白HMGB1[5-7]。免疫原性標(biāo)志物的表達(dá)會提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的清除作用。目前已知不同分子分型乳腺癌對于化療藥物的敏感性不同，三陰性乳腺癌化療的緩解率明顯高于其他分子分型[2]，但其原理及作用機(jī)制尚未闡明。表阿霉素為常用蒽環(huán)類化療藥物之一。本研究旨在揭示表阿霉素作用于不同乳腺癌細(xì)胞系是否存在免疫原性死亡機(jī)制，不同分子分型乳腺癌化療敏感性是否與此有相關(guān)性。免疫原性細(xì)胞死亡是化療的主要目標(biāo)之一?；煹闹饕康氖谴龠M(jìn)癌細(xì)胞的死亡，而免疫原性死亡可促進(jìn)免疫系統(tǒng)通過“旁路效應(yīng)”消除化療耐藥細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞[12-14]，這些免疫效應(yīng)可能對化療療效有促進(jìn)或增強(qiáng)作用。研究藥物的免疫原性作用機(jī)制對于治療乳腺癌和選擇藥物敏感性分子分型乳腺癌有重要意義。本研究表明表阿霉素對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖的影響不同，對激素受體陰性細(xì)胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的化療敏感性明顯高于激素受體陽性的MCF-7(P<0.05)。并且MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系的表阿霉素IC50值明顯低于其他細(xì)胞系，提示激素受體陰性的乳腺癌化療敏感性高于其他細(xì)胞系，此與Ebctc等[2]報道的結(jié)果一致。

作為蒽環(huán)類化療藥物之一的表阿霉素，其化療作用中是否存在免疫原性死亡機(jī)制，不同分子分型乳腺癌是否對表阿霉素化療的敏感性不同，其作用原理是否與免疫原性死亡程度不同有關(guān)均需回答。本研究進(jìn)一步檢測免疫原型標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果提示鈣網(wǎng)蛋白、HSP70隨著表阿霉素作用時間的增加而增加，在激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的增長率明顯高于SKBR3和MCF-7細(xì)胞系；比較表阿霉素作用24h后鈣網(wǎng)蛋白和HSP70的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞系中明顯高于激素受體陽性細(xì)胞系MCF-7(P<0.001)。結(jié)果提示:(1)表阿霉素的作用過程不僅包括細(xì)胞毒性作用，還潛在免疫原性死亡作用過程；(2)激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞死亡過程中的免疫原性死亡作用較強(qiáng)。

本研究仍存在一定的局限性：(1)免疫原性標(biāo)志物眾多，未進(jìn)行一一檢測；(2)基礎(chǔ)實驗較單薄，需加入動物實驗及組織標(biāo)本實驗。后續(xù)研究可進(jìn)一步探索腫瘤傳統(tǒng)化療有機(jī)結(jié)合免疫治療的策略，從而指導(dǎo)個體的化療及療效的預(yù)后評估。

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(本文編輯 周芳)

The effect of Epirubicin on breast cancer cell lines

WANG Bowei1, MA Fangjing2, LIU Ming1, SANG Wei1, ZHANG Wei1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofBreastSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Objective The effect of Epirubicin on different breast cancer cell lines. Methods The human breast cancer cell lines MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 and MDA-MB-468 were treated with Epirubicin respectively, and the markers of immunogenic cell death were detected by flow cytometry; the proliferation of cell was tested by CCK-8 method. Results (1) After treating for 24 h, the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 was lower than MCF-7 (P<0.005). (2)IC50ofEpirubicintoMDA-MB-231andMDA-MB-468waslowerthanMCF-7andSKBR3. (3)TheamountofcalreticulinandHSP70wasincreasedgraduallywiththetreatmentofEpirubicin;after24hours,thesemarkersofMDA-MB-231andMDA-MB-468weresignificantlyhigherthanthatofMCF-7 (P<0.001).ThebothmarkersofSKBR3werehigherthanthatofMCF-7,butnotsignificantly(P>0.005). Conclusion The effect of Epirubicin not only includes cytotoxic effect, but also potential immunogenicity death process. During the process of cell death, the immunogenicity death effect of hormone receptor negative breast cancer cell is stronger.

epirubicin; breast cancer; immunogenic cell death

新疆維吾爾族自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C049)

王?，|(1981-),男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：乳腺癌分子病理。

張 巍，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：乳腺癌分子病理，E-mail: wbw_feng132@126.com。

R

A

1009-5551(2015)12-1520-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.017

2015-01-04]