段美艷，李安寧，趙志東，王明明，昝林森，2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建與活性檢測

段美艷1，李安寧1，趙志東1，王明明1，昝林森1，2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

【目的】 構(gòu)建牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并檢測其在C2C12細(xì)胞系中的表達(dá)活性?！痉椒ā?從牛外周血中提取基因組DNA，通過PCR方法從牛基因組DNA中克隆獲得牛ATP5B基因的5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的 1 898 bp目的片段，通過設(shè)計(jì)引物逐段缺失后獲得7個(gè)亞克隆，將其純化后經(jīng)SmaⅠ和KpnⅠ雙酶切與pGL3-Basic載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，得到牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系后，檢測7個(gè)重組質(zhì)粒的熒光素酶活性；運(yùn)用在線軟件Gen-omatix和TFSEARCH對ATP5B啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】 成功克隆獲得7個(gè)系列缺失的牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145；通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞和熒光素酶活性分析，可知構(gòu)建的重組質(zhì)粒均有啟動(dòng)子活性，且重組質(zhì)粒pATP5B-678和pATP5B-462與空載體pGL3-Basic的熒光素酶活性差異極顯著。軟件分析結(jié)果顯示，ATP5B基因啟動(dòng)子區(qū)域 -763～-85 bp存在多個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。【結(jié)論】 成功構(gòu)建了7個(gè)系列缺失的牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，且證實(shí) -763～-230 bp為牛ATP5B基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

牛；ATP5B基因啟動(dòng)子；雙熒光素酶報(bào)告基因載體

線粒體ATP合酶是三磷酸腺苷酶(ATPase)的一種，它利用呼吸鏈產(chǎn)生質(zhì)子的電化學(xué)勢能，可通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來合成ATP，對于細(xì)胞的功能及其凋亡有著重要的作用。ATP5B是ATP合酶的β催化亞基，對于整個(gè)酶而言，其是催化亞單位，在真核細(xì)胞中它催化ATP合成的限速反應(yīng)，是細(xì)胞氧化磷酸化通路上的重要蛋白[1]。此外，ATP5B也是一種代謝蛋白，在生長和發(fā)育過程中，其對于調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞和肌原纖維蛋白降解的生化和生理過程起著重要的作用[2-3]，另外許多研究都表明，ATP5B可能對肌內(nèi)脂肪含量和骨骼肌的氧化代謝等有著重要影響[4-8]。

人類ATP5B基因定位于染色體12q13.13，大約有7.8 kb，含10個(gè)外顯子，編碼 480個(gè)氨基酸，mRNA水平分析結(jié)果表明ATP5B基因具有組織差異性表達(dá)特點(diǎn)，在心臟中高水平表達(dá)，在骨骼肌中低水平表達(dá)，在肝臟和腎臟中表達(dá)量最低[9]。豬的ATP5B基因定位于染色體5p11-p15，該基因mRNA不僅在14個(gè)組織中廣泛表達(dá)，而且在脂肪組織和附睪中顯著高表達(dá)；而在大白豬和眉山豬2個(gè)品種的6個(gè)發(fā)育階段中，ATP5B在以上2個(gè)品種豬各組織的表達(dá)情況相似，但在各個(gè)發(fā)育階段眉山豬的ATP5B表達(dá)量都顯著高于大白豬[10]。在牛上，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，查詢得到牛ATP5B基因(GenBank 登錄號:AC_000162.1)定位于5號染色體，全長 5 374 bp，含10個(gè)外顯子，應(yīng)用SECentral軟件分析牛ATP5B基因mRNA序列，結(jié)果顯示其編碼528個(gè)氨基酸，5′UTR含19個(gè)核苷酸，3′UTR含168個(gè)核苷酸。以往對牛心臟線粒體ATP合酶結(jié)構(gòu)的研究較多，且證實(shí)了ATP5B基因序列在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中高度保守[11]，近年來從分子水平分析編碼ATP合酶基因及其功能的研究也較多。

研究編碼線粒體ATP合酶的基因，對于系統(tǒng)了解ATP合酶的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，進(jìn)而在分子水平上提高肉牛生產(chǎn)性能和牛肉品質(zhì)具有重要意義。目前，關(guān)于牛ATP5B基因的研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ATP5B基因啟動(dòng)子的DNA序列，并將其插入雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，構(gòu)建了在骨骼肌和肌內(nèi)脂肪形成中發(fā)揮重要作用的牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究ATP5B基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

pGL3-Basic質(zhì)粒及雙熒光素酶基因內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK，購自Promega公司；大腸桿菌DH 5α由國家肉牛改良中心實(shí)驗(yàn)室保存；基因組DNA提取試劑盒購自Tiangen公司；pMD-19T載體，SmaⅠ、KpnⅠ酶，T4 DNA連接酶，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA膠快速回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Promega公司；DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。

1.2 牛ATP5B基因啟動(dòng)子及其7個(gè)逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增

1.2.1 牛ATP5B基因啟動(dòng)子序列的克隆 按Tiangen公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒說明提取牛外周血基因組DNA ，置于-20 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中牛ATP5B基因(GenBank 登錄號:AC_000162.1)的啟動(dòng)子區(qū)序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)合成1對用于擴(kuò)增ATP5B基因啟動(dòng)子區(qū)上游-1 982～-85 bp的引物：上游引物ATP5B-F0序列為5′-CAGTCTTCTCCTTATTCCTCTGCTA-3′ ，下游引物ATP5B-R序列為5′ -TCTGCTTATCACTCTGGGCG-3′，利用計(jì)算機(jī)輔助分析引物結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該對引物滿足PCR反應(yīng)所需條件，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

以牛外周血基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，具體組成為：10×Buffer 2.0 μL，KOD 0.4 μL，MgSO40.8 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物0.6 μL，滅菌超純水12.6 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃變性5 min； 94 ℃變性 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以滅菌超純水為陰性對照。將PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化。對純化產(chǎn)物加A尾，反應(yīng)體系(10 μL)為：Mix 5 μL，DNA 5 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃ 20 min。之后將產(chǎn)物與pMD-19T載體在16 ℃恒溫儀上過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布平板，在氨芐選擇培養(yǎng)基上于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，先進(jìn)行菌液PCR檢測，再從菌液中提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2 牛ATP5B基因啟動(dòng)子7個(gè)逐段缺失片段的克隆與PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)7條可以擴(kuò)增逐段缺失啟動(dòng)子序列的上游引物(ATP5B-F1～F7)及下游引物ATP5B-R，上游引物都包含KpnⅠ酶切位點(diǎn),下游引物包含SmaⅠ酶切位點(diǎn)，并分別添加了相對應(yīng)的保護(hù)堿基CGG和TCC(表1)。

表1 供試的PCR引物序列 Table 1 PCR primers used in the experiment

注：“_”和“ ”分別表示酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列。

Note:Restriction cnzyme cutting sites and protective bases are indicated by “_” and “ ”,respectively.

以1.2.1中菌液為模板，用7對逐段缺失引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為15 μL：Mix 7.5 μL，菌液 1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.3 μL，下游引物(10 μmol/L)0.3 μL，滅菌超純水 5.9 μL。PCR擴(kuò)增程序同1.2.1。以滅菌超純水為陰性對照。將PCR產(chǎn)物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收純化。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定與測序

將純化后的7個(gè)ATP5B基因逐段缺失啟動(dòng)子目的片段和pGL3-Basic 載體用KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切3 h后，于16 ℃恒溫儀上過夜連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布平板，在氨芐選擇培養(yǎng)基上于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 20 h，將菌液進(jìn)行PCR檢測后提取質(zhì)粒，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pAT-P5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145，用KpnⅠ和SmaⅠ 進(jìn)行雙酶切鑒定，并測序鑒定重組質(zhì)粒陽性克隆(測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

按照LipofectaminTMReagent 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說明，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)C2C12細(xì)胞系，將生長狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞系按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至24孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待單層細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。每孔分別定量加入 pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145 載體質(zhì)粒800 ng，pRL-TK內(nèi)參載體10 ng，以pGL3-Basic質(zhì)粒為陰性對照，pGL3-Control質(zhì)粒為陽性對照，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。每組試驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.5 熒光素酶活性的測定

熒光素酶活性測定基本按照Promega公司生產(chǎn)的雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟簡述如下:棄去24孔細(xì)胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗細(xì)胞2次；加100 μL細(xì)胞裂解液(1×PLB)，搖床振蕩15 min，取20 μL細(xì)胞裂解液至檢測管中，加入50 μL LAR Ⅱ混勻放入儀器中讀數(shù)，取出檢測管，加50 μL Stop/Glo試劑，混勻后放入儀器中讀數(shù)，記錄 Firefly-Luc/Renilla Luc的比值，并以空載體pGL3-Basic的比值為陰性對照，分析啟動(dòng)子活性。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過GenBank檢索并下載ATP5B基因上游啟動(dòng)區(qū)2 kb DNA序列，應(yīng)用在線軟件Gen-omatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector)、TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)對其啟動(dòng)子區(qū)域的序列特征進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SSPS 18.0軟件包對各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的顯著性進(jìn)行單因素方差分析(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛ATP5B基因啟動(dòng)子及其逐段缺失片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以牛外周血基因組DNA為模板，通過上游引物ATP5B-F0和下游引物ATP5B-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，克隆得到牛ATP5B基因5′側(cè)翼區(qū) 1 898 bp片段(圖1)；用逐段缺失啟動(dòng)子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大小與預(yù)期結(jié)果一致的7個(gè)片段(圖2)，利用SECentral軟件，將測序結(jié)果與GenBank所報(bào)道的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)所克隆的序列中位于第一外顯子上游第 1 096 個(gè)堿基處發(fā)生C→T突變(圖3)。

圖1 牛ATP5B基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增結(jié)果 M．DL2000 DNA Marker；1.ATP5B啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物；2.陰性對照Fig.1 PCR product of ATP5B promoter M．DL2000 DNA Marker;1.PCR product of ATP5B;2.Negative control

圖2 牛ATP5B基因啟動(dòng)子7個(gè)逐段缺失片段的PCR結(jié)果 M1、M2.DL2000 DNA Marker；1～7.ATP5B啟動(dòng)子7個(gè)亞克隆PCR產(chǎn)物；8.陰性對照Fig.2 The 7 sub-clones of ATP5B promoter M1,M2.DL2000 DNA Marker;1-7.PCR products of 7 ATP5B promoter sub-clones;8.Negative control

圖3 牛ATP5B啟動(dòng)子克隆片段與NCBI中ATP5B基因序列的比對結(jié)果
A.原始序列；B.克隆序列；標(biāo)△處為發(fā)生突變的位點(diǎn)
Fig.3 Comparison of bovineATP5Bpromoter clone fragment sequence analysis with origin sequence in NCBI
A．Original series;B.Cloning sequence;Mutation site is indicated by △

2.2 牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體的鑒定

PCR產(chǎn)物以及pGL3-Basic載體用KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切后回收，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pAT-P5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切后，分別釋放出1 898，1 607，1 293，992，678，462和145 bp片段(圖4)。測序結(jié)果證實(shí)了pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293均在第一外顯子上游第1 096個(gè)堿基處發(fā)生C→T突變，pATP5B-678、pATP5B-462、pATP5B-145插入序列完全正確，證明ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 牛ATP5B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果M1.1 kb Ladder Marker；M2.DL2000 DNA Marker；m.pGL-Basic的KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切產(chǎn)物；1～7.7個(gè)重組質(zhì)粒的KPnⅠ和SmaⅠ雙酶切產(chǎn)物Fig.4 Identification of the constructed plasmids of bovine ATP5B gene promoter dual luciferase report gene by two restriction enzymes digestionM1.1 kb Ladder Marker;M2.DL2000 DNA Marker;m.Cleavage of of pGL-Basic blank plasmid digested by KpnⅠand SmaⅠ;1-7.7 recombined plasmids digested by restriction enzymes KpnⅠand SmaⅠ

2.3 牛ATP5B基因啟動(dòng)子7個(gè)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶活性檢測

用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染法將重組正確的7個(gè)報(bào)告基因載體和pGL3-Basic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，結(jié)果(圖5)表明，構(gòu)建的7個(gè)報(bào)告基因重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性均較pGL3-Basic空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著增加(P<0.05)，其中pATP5B-678和pATP5B-462組的熒光素酶活性較pGL3-Basic空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組極顯著增加(P<0.01)，但pATP5B-678與pATP5B-462組之間的熒光素酶活性差異不明顯，這表明pATP5B-678與pATP5B-462之間的區(qū)域 -763～-230 bp可能包含核心啟動(dòng)子區(qū)域。

圖5 牛ATP5B基因啟動(dòng)子7個(gè)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶活性 *和**分別表示與pGL3-Basic空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的差異達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)Fig.5 Activities of bovine ATP5B gene promoter 7 report gene vectors after being transfected into cells* and ** mean significantly difference at (P<0.05) and (P<0.01),respectively,as compare to pGL3-Basic

2.4 牛ATP5B基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Gen-omatix和TFSEARCH軟件對牛ATP5B基因啟動(dòng)子區(qū)域 -763～-85 bp 進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果(圖6)顯示，該區(qū)域除了包含TATA盒、CAAT盒、 GATA-1盒、GATA-2盒外，還有CdxA、v-Myb、deltaE、 C/EBPα和C/EBPβ等一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

3 討 論

近年來關(guān)于ATP5B基因研究較多，且主要集中于對其功能的分析驗(yàn)證方面。ATP5B除了參與能量代謝外，還可以作為多種配體的受體參與脂類代謝調(diào)控、控制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化以及作為腫瘤的免疫識(shí)別標(biāo)志。有研究表明，ATP5B不僅在線粒體內(nèi)膜以結(jié)構(gòu)蛋白形式表達(dá)，并參與F1-ATPase 催化反應(yīng)，還分布于細(xì)胞膜的表面[12]。在C2C12肌管細(xì)胞發(fā)育過程中，細(xì)胞膜上不規(guī)則定位的ATP5B與鈣離子通道α2/δ1亞基互作，從而形成了一個(gè)可以調(diào)控鈣離子釋放的功能信號復(fù)合物，此調(diào)控過程已通過重復(fù)性地電刺激肌管試驗(yàn)被證實(shí)[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的ATP5B能與抑制素結(jié)合，表明膜結(jié)合的ATP5B參與了血管的形成[13]?？傊?，這些研究表明ATP5B除了參與氧化磷酸化反應(yīng)之外，在骨骼肌和血管形成上也發(fā)揮著重要作用。另外，在肝臟分解代謝過程中，高密度脂蛋白(HDL)通過干擾作用于內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡因子而起保護(hù)作用，HDL攜帶的脂蛋白和酶具有抗氧化的功能[14]。肝細(xì)胞的表層ATP5B作為富含載脂蛋白AI或載脂蛋白E的高密度脂蛋白的受體，在HDL的代謝機(jī)理和ATP的生物合成中起重要作用。此外，Zheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，單純皰疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染時(shí)，宿主細(xì)胞編碼的miR-101表達(dá)增強(qiáng)，會(huì)抑制ATP5B活性以減少細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，從而影響病毒復(fù)制，起到抗病毒作用。

圖6 牛ATP5B啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果
Fig.6 Predicted binding sites for transcription factors in bovineATP5Bgene 5′ flanking region

本研究通過逐段缺失牛ATP5B基因啟動(dòng)子區(qū)，成功構(gòu)建了7個(gè)5′端不等、3′端平齊的啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系對這些重組質(zhì)粒的活性進(jìn)行了分析，定位了與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件所在位置為pATP5B-678與pATP5B-462的約500 bp (-763～-230 bp)區(qū)域，且該區(qū)域是牛ATP5B基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

運(yùn)用在線軟件Gen-omatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector)、TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)對該區(qū)域核心啟動(dòng)子序列特性進(jìn)行分析，并對比Xu等[10]對豬ATP5B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)軟件預(yù)測結(jié)果，可知該區(qū)域包含有GATA盒及v-Myb、deltaE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，而Xu等[10]的研究結(jié)果顯示，豬的APT5B啟動(dòng)子區(qū)沒有TATA盒、CAAT盒這2個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。GATA盒是具有調(diào)控靶基因表達(dá)水平作用的轉(zhuǎn)錄因子家族，有保守的鋅指結(jié)構(gòu)。Tong 等[16]報(bào)道， GATA盒在脂肪的形成中起重要作用，尤其是GATA-2、GATA-3。v-Myb是一個(gè)轉(zhuǎn)錄活化因子。Karafiat等[17]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件v-Myb 和c-Myb 參與血液祖細(xì)胞及其前體細(xì)胞的分化，且對于NC(神經(jīng)脊) 細(xì)胞有相似的作用,都是通過激活SCF/c-kit 信號通路來作用于黑色素細(xì)胞系的分化[18]。C/EBPα和C/EBPβ則對于誘導(dǎo)細(xì)胞分化及調(diào)控脂肪形成有重要作用。本研究中，以上轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在ATP5B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中的具體作用還不明確，但確定了牛ATP5B基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，可以為ATP5B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)下一步的研究重點(diǎn)是探明重要的順式作用元件及其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中所起的作用。

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Construction and identification of bovineATP5Bgene promoter dual luciferase report gene vector

DUAN Mei-yan1,LI An-ning1,ZHAO Zhi-dong1,WANG Ming-ming1,ZAN Lin-sen1,2

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The research was conducted to construct the dual luciferase reporter gene plasmid ofATP5Bgene promoter from bovine and detect the expression activities by transfecting into the C2C12 cells.【Method】 Bovine genome DNA was extracted from blood cells,and from which a 1 898 bp fragment of the 5′ flanking region ofATP5Bgene was isolated by PCR.Then 7 sub-clones were obtained by the design of primers.The PCR products were purified and double digested bySmaⅠ andKpnⅠ before being inserted into pGL3-Basic vectors by homologous recombination and the vectors were transferred into DH5α cells.At last,dual luciferase report gene vectors of bovineATP5Bgene promoter were constructed and transfected into the C2C12 cells by LPS before the activities of 7 recombined plasmids were measured and the sequence ofATP5Bgene 5′ end was analyzed by online software.【Result】 A total of 7 recombined plasmids (pATP5B-1898,pATP5B-1607,pATP5B-1293,pATP5B-992,pATP5B-678,pATP5B-462,and pATP5B-145) of bovineATP5Bgene promoter dual luciferase report gene vectors were successfully cloned.Luciferase activity assay indicated that all the recombined plasmids had significant activity.pATP5B-678 and pATP5B-462 had extremely significant difference compared to pGL3-Basic.Sequence analysis by Gen-omatix and TFSEARCH indicated that there were many putative binding sites for transcription factors in the region of -763--85 bp ofATP5Bgene promoter.【Conclusion】 A total of 7 dual luciferase report gene recombined plasmids of bovineATP5Bgene promoter were successfully constructed,activity analysis in C2C12 cells indicated that the regionsof -763--230 bp contained key transcription regulatory elements.

bovine;ATP5Bpromoter;dual-luciferase reporter

2014-01-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272411)；國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102505，2011AA100307-02)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD28B04-03)；國家轉(zhuǎn)基因育種專項(xiàng)(2011ZX08007-002)；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-38)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2014KTZB02-02)

段美艷(1990-)，女，山西五臺(tái)人，碩士，主要從事肉?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控研究。E-mail：dmy.sunny.2008@163.com

昝林森(1963-)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛奶牛遺傳改良與健康養(yǎng)殖研究。 E-mail：zanlinsen@163.com

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.026

Q78；S823.8

A

1671-9387(2015)08-0039-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.026.html