張大愛，杜 瑩，錢一萍，趙緒明，高金鋒，王鵬科，高小麗，楊 璞，馮佰利

(西北農(nóng)林科技大學(xué)/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

甜蕎結(jié)實性及授粉受精過程中花粉管的生長動態(tài)

張大愛，杜 瑩，錢一萍，趙緒明，高金鋒，王鵬科，高小麗，楊 璞，馮佰利

(西北農(nóng)林科技大學(xué)/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

【目的】 探究甜蕎的結(jié)實性及授粉受精過程中花粉管的生長動態(tài)，為甜蕎自交不親和性機理的研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 以同型花和異型花甜蕎品種為材料，在溫室條件下利用自然和人工雜交授粉， 調(diào)查結(jié)實率，并對異型花品種的自交和雜交花柱進(jìn)行熒光顯微觀察?！窘Y(jié)果】 1)同型花品種結(jié)實率31.5%～72.7%，其為自花結(jié)實性品種；異型花品種的結(jié)實率為0～6.3%，其為自花不結(jié)實品種。2)異型花的異類型花之間雜交結(jié)實，其中以長花柱為母本雜交時的結(jié)實率高于以短花柱為母本雜交時的結(jié)實率；異型花的同類型花之間雜交時不結(jié)實或結(jié)實率很低，少量的結(jié)實發(fā)生在長花柱與長花柱類型雜交之間。3)在異型花品種中，長花柱與長花柱雜交授粉，花粉萌發(fā)，花粉管伸長，但在花柱的2/3處(時間為1～1.5 h)被抑制，其識別部位尚不清楚；短花柱與短花柱雜交授粉，花粉萌發(fā)，但花粉管沒有伸長，因此其識別和抑制部位均在柱頭；異類型花之間雜交花粉管發(fā)育正常，并且花粉發(fā)育速度快于同類型花之間雜交?！窘Y(jié)論】 異型花甜蕎自交或同類型花之間雜交，花粉管在柱頭或花柱中被抑制使甜蕎結(jié)實率降低，從而降低產(chǎn)量。同型花品種自交可育，結(jié)實率提高，培育同型花甜蕎是提高產(chǎn)量的有效手段。

甜蕎；自交不親和性；結(jié)實性；花粉發(fā)育

蕎麥(FagopyrumesculentumMonch.)營養(yǎng)豐富[1]，富含黃酮等生物活性物質(zhì)[2-3]，是21世紀(jì)營養(yǎng)保健食品資源。蕎麥有2個栽培種，分別是甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtataricumGaerth)。甜蕎有2種花型，即同型花和異型花，其中同型花雌雄蕊等長，能夠自花授粉結(jié)實，常見于野生種中；異型花為雌雄蕊不等長，有2種類型，即雌蕊長于雄蕊(長花柱)和雌蕊短于雄蕊(短花柱)。

目前栽培甜蕎均為異型花，群體(品種)中長花柱和短花柱的比例各約占50%。異型花自花授粉或同類型花植株之間相互授粉不結(jié)實，具有自交不親和現(xiàn)象[4]，授粉結(jié)實主要是在具有不同類型花的植株之間進(jìn)行的，即在長花柱花與短花柱花，或者短花柱花與長花柱花植株之間雜交，而且為蟲媒花，主要依靠昆蟲進(jìn)行異花授粉[5-7]。甜蕎的自交不親和性及其異花授粉特性導(dǎo)致其結(jié)實率低，是影響甜蕎產(chǎn)量的重要因素。由于甜蕎為無限開花習(xí)性，并且難以控制授粉條件，有關(guān)甜蕎結(jié)實率的研究較少且缺乏確切的數(shù)據(jù)支撐，尤其是對甜蕎自交不親和性的機制研究幾乎空白。

本研究在溫室無風(fēng)、無昆蟲的條件下，通過自然和人工雜交對甜蕎的結(jié)實率進(jìn)行了統(tǒng)計，并利用熒光顯微技術(shù)觀察了甜蕎自花和異花授粉受精過程中花粉管的生長動態(tài)，旨在為甜蕎自交不親和性的機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜蕎材料

試驗于2012-2013年在西北農(nóng)林科技大學(xué)E04號溫室進(jìn)行。試驗甜蕎品種包括：同型花品種12JTJ-3、12JTJ-6，均為本課題組選育；異型花品種北早生、TQ11-6、溫莎甜蕎，均為本課題組保存和繁殖。采用盆栽試驗，且同品種同類型花的甜蕎種植在同一個盆里，每盆種植3～5株。

1.2 自交、雜交方式及結(jié)實率統(tǒng)計

自然授粉是在溫室隔離條件下自交，統(tǒng)計各個花柱類型的結(jié)實率?；ㄆ谠诟骰ㄖ愋?長花柱、短花柱、等花柱)分植株上、中、下層共標(biāo)記3～5個花簇，從每個花簇第1朵花開開始，每天統(tǒng)計開花花朵并標(biāo)記，直到最后一朵花開結(jié)束，得到每個花簇的花數(shù)，成熟期統(tǒng)計該花簇的結(jié)實粒數(shù)，結(jié)實粒數(shù)占開花花數(shù)的百分率即為結(jié)實率。

人工授粉分為同花授粉和異花授粉。同花授粉采用人工涂抹，花期標(biāo)記花簇，每天分2次(上午、下午)用毛筆涂抹開花花朵，統(tǒng)計開花花朵并套袋，直到最后一朵花開結(jié)束，成熟期統(tǒng)計結(jié)實粒數(shù)計算出結(jié)實率。異花授粉采用人工雜交，由于甜蕎具有自交不親和現(xiàn)象，因此在雜交時沒有去雄。選擇剛開花花朵，去除同花簇上已開花朵和未開花蕾，并剪掉花簇生長頂端，取異花新鮮花粉授粉，套袋隔離，成熟期統(tǒng)計授粉的花數(shù)和結(jié)實粒數(shù)。

1.3 雜交花柱處理及熒光顯微觀察

人工授粉共6組雜交組合，即長花柱×長花柱(包括同品種和異品種)、短花柱×短花柱(包括同品種和異品種)、長花柱×短花柱(包括同品種和異品種)。分別在授粉后0.5，1，1.5，2，2.5，3 h取下花柱，放在體積分?jǐn)?shù)90%乙醇與冰乙酸體積比為3∶1的混合溶液中固定1 h，然后在60 ℃的1 mol/L NaOH中清洗1～2 h。再用苯胺藍(lán)溶液染色1 h。將雌蕊固定在載片上，滴上苯胺藍(lán)染色液，然后輕輕蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡(B202，日本奧林巴斯)下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然授粉條件下甜蕎的結(jié)實性

自然授粉條件下不同類型甜蕎的結(jié)實情況見表1。從表1可以看出，同型花品種結(jié)實率在31.5%～72.7%，而異型花品種長花柱、短花柱類型結(jié)實率在0～6.3%。因此，同型花品種為自花結(jié)實性品種，異型花品種為自花不結(jié)實品種。異型花品種中少量的結(jié)實(6.3%)在長花柱類型中。

表1 自然授粉條件下不同類型甜蕎的結(jié)實率Table 1 Seed setting rate of different varieties under natural pollination condition

2.2 人工授粉條件下各類型甜蕎的結(jié)實性

從表2可以看出，異型花的同類型花(無論是同品種還是異品種)之間雜交時，基本不結(jié)實或結(jié)實率很低，即同類型花之間是不親和的，少量的結(jié)實出現(xiàn)在長花柱與長花柱類型的雜交之間。同型花之間、異型花的異類型花(無論是同品種還是異品種)之間以及以長花柱為母本的異型花與同型花之間雜交結(jié)實，而以短花柱為母本的異型花與同型花之間雜交結(jié)實率低或不結(jié)實。

表2 人工授粉條件下不同類型甜蕎的結(jié)實率 Table 2 Seed setting rate of different varieties under artificial pollination condition

續(xù)表2 Continued table 2

注：同品種同類型花、異品種同類型花的所有雜交組合中包括同花、同株異花、異株異花授粉。

Note:Same type flowers of the same varieties and different varieties were self-pollinated and cross-pollinated by flower,flower type,plant and variety.

2.3 甜蕎授粉受精過程的熒光顯微觀察結(jié)果

甜蕎異型花品種中異類型花和同類型花雜交授粉后花粉的萌發(fā)及花粉管的發(fā)育情況見圖1和圖2。由圖1和圖2可以看出，短花柱×短花柱(無論同品種還是異品種)，從0.5 h至3 h，花粉萌發(fā)，但花粉管一直停留在柱頭的位置沒有伸長；長花柱×長花柱(無論同品種還是異品種)，授粉后0.5 h花粉管大致伸長到花柱1/2處，授粉后1～1.5 h大致伸長到花柱的2/3處，并且不再伸長，從2 h開始出現(xiàn)縮短的現(xiàn)象；長花柱×短花柱(無論同品種還是異品種)，授粉后0.5 h已經(jīng)伸長到花柱的約2/3處，授粉后1～1.5 h已經(jīng)接近珠孔，授粉后2 h已經(jīng)通過珠孔進(jìn)入胚囊進(jìn)行受精。因此，從時間上看異類型花授粉后花粉管的伸長速度較快。

圖1 甜蕎異型花品種中異類型花雜交授粉后花粉的萌發(fā)及花粉管的發(fā)育從左到右依次分別表示授粉后0.5，1，1.5， 2，2.5，3 h Fig.1 Pollen germination and pollen tube development of different types of distinct mode flowers of common buckwheat after cross-pollinationThe figures from left to right show the pollens 0.5,1,1.5,2,2.5 and 3 h after pollination

圖2 甜蕎異型花品種中同類型花雜交授粉后花粉的萌發(fā)及花粉管的發(fā)育a、b分別為短花柱×短花柱、長花柱×長花柱；從左到右依次分別表示授粉后0.5，1，1.5， 2，2.5，3 h Fig.2 Pollen germination and pollen tube development of same types of distinct mode flowers of common buckwheat after cross-pollinationa,b stand for combinations between the short style flowers,the long style flowers of same types;The figures from left to right show the pollens 0.5,1,1.5,2,2.5 and 3 h after pollination

3 討 論

目前栽培甜蕎均為異型花品種，自花和同類型花雜交不結(jié)實或結(jié)實率很低，異花授粉受氣候、昆蟲等條件的影響其結(jié)實率也很低。本研究利用同型花甜蕎品種為試驗材料，證明其自交、雜交均能夠結(jié)實，這為利用這些材料培育自花結(jié)實甜蕎品種奠定了基礎(chǔ)。

高立榮等[7]利用套袋進(jìn)行自交或互交方式的研究表明，普通蕎麥異類型花自花或同類型花之間雜交也有結(jié)實,而且結(jié)實均在長花柱自交或長花柱與長花柱的雜交之間。本研究利用人工雜交對同品種和異品種自花或同類型花甜蕎之間雜交結(jié)實率的調(diào)查數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證明了這一觀點。

唐宇等[8]研究表明，蕎麥種間雜交時，以短花柱型為母本，長花柱型為父本，其雜交的親和力較高。本研究是利用甜蕎品種間的雜交進(jìn)行分析，結(jié)果表明，以長花柱型為母本，其雜交的親和力比其反交時或以短花柱型為母本雜交時的親和力高；從花粉發(fā)育的熒光顯微觀察結(jié)果也可以看出，短花柱與短花柱品種雜交花粉管不伸長，長花柱與長花柱品種雜交花粉管伸長到花柱2/3處停止伸長，而長花柱與短花柱品種雜交花粉管正常生長，并且發(fā)育時間上快于以上2種雜交。這是否由于種間雜交與品種間雜交的花粉與花柱親和力不同，還是長花柱與短花柱對外來花粉的識別、抑制等反應(yīng)不同而造成的，還有待進(jìn)一步研究。

孟金陵[9]對甜蕎的研究證實，長花柱與長花柱品種授粉抑制部位在花柱，短花柱與短花柱品種授粉抑制部位在柱頭。高立榮等[7]也認(rèn)為，短花柱型授粉抑制部位在柱頭，且花粉粒不萌發(fā)。本研究采用熒光顯微觀察了異型花甜蕎中同類型花和異類型花之間雜交授粉后花粉萌發(fā)和花粉管的發(fā)育動態(tài)過程，并且確定了各自抑制的具體部位，而且也發(fā)現(xiàn)短花柱與短花柱雜交授粉后柱頭上的花粉萌發(fā)但不伸長，證明了長花柱和短花柱2種類型授粉的抑制部位不同。

前人對許多植物的自交親不和性生理研究認(rèn)為，授粉后柱頭和花柱內(nèi)生理活性物質(zhì)的變化是引起自交不親和的重要因素。如對甘藍(lán)的自交不親和性研究表明，授粉后由于在自花授粉柱頭上SOD、POD、CAT活性明顯低于異花授粉柱頭，并且花柱內(nèi)蛋白質(zhì)含量有一定的變化，因而抑制自體花粉萌發(fā)或生長[10]。相關(guān)研究表明，花粉管在柱頭中生長時，柱頭細(xì)胞中ATPase活性[11]、花粉管頂端Ca2+分布[12]、花粉管中核DNA[13]以及花粉管頂端的胼胝質(zhì)反應(yīng)[14]等均發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致花粉管停止生長。至于甜蕎授粉后柱頭或花柱中發(fā)生了哪些生理抑制現(xiàn)象從而導(dǎo)致了自交不親和，這還有待進(jìn)一步深入研究。

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Fecundity of common buckwheat and dynamic growth of pollen tube in pollination and fertilization

ZHANG Da-ai,DU Ying,QIAN Yi-ping,ZHAO Xu-ming,GAO Jin-feng,WANG Peng-ke,GAO Xiao-li,YANG Pu,FENG Bai-li

(StateKeyLaboratoryofAridRegionCropAdversityBiologyCollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated fecundity of common buckwheat and dynamic growth of pollen tube in pollination and fertilization to provide foundation for the study of self-incompatibility mechanism of common buckwheat.【Method】 In greenhouse,same type flowers and heteromorphic flowers were chosen to study seed-setting rates by naturally and artificially pollinating and to examine the self-pollinated and cross-pollinated styles by fluorescence microscopy.【Result】 (1) The seed setting rate of same type flower was 31.5%-72.7%,so it belonged to self-pollinated species.The heteromorphic flowers were self-incompatibilities with seed setting rate of 0-6.3%.(2) Common buckwheat species crossed with heteromorphic flowers presented higher seed setting rates with their long style flowers as the female parents than with their short style flowers as the female parents.No seeds or very low seeds occurred when own different types of flowers were cross-pollinated.(3) In different heteromorphic flower species,when different long style were cross-pollinated,their pollens germinated but their pollen tubes got inhibited at two third of the style length (1-1.5 h after pollination).Recognition and inhibition sites of the pollen tubes were still elusive. When crossed between different short style,their pollens could germinate but their pollen tubes could not elongate,so both recognition and inhibition sites were at the stigma.When the different heteromorphic flowers were cross-pollinated,their pollen tubes developed normally and pollen developed faster than that of the same type flowers formed when they were cross pollinated.【Conclusion】 When common buckwheat and heteromophic flowers were self-pollinated or their different types of flowers were cross-pollinated,their pollen tubes were inhibited at the stigma or the style,which was the main reason of decreased seed setting rate and production.When same type flowers were self fertile,the seed setting rate increased.Therefore,breeding for same type flower variety is an effective tool to improve the yield of common buckwheat.

common buckwheat;self-incompatibility;seed setting rate;pollen development

2014-02-11

陜西省科技統(tǒng)籌項目(2014KTZB02-03-03)；榆林市產(chǎn)學(xué)研合作項目(2014cxy-03-02)；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項目(A212020901)；陜西省小雜糧產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(K336021201)

張大愛(1987-)，女，安徽宿州人，碩士，主要從事小雜糧遺傳育種及高產(chǎn)生態(tài)生理研究。 E-mail:1290396861@qq.com

王鵬科(1963-)，男，陜西岐山人，副教授，碩士生導(dǎo)師， 主要從事小雜糧遺傳育種研究。

時間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.003

S517.032

A

1671-9387(2015)08-0103-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.003.html