姜倩，張加研*，秦永劍，雷福厚

(1.西南林業(yè)大學材料工程學院，云南 昆明 650224;2.廣西民族大學廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006)

通常所稱的肉桂為樟科常綠喬木植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干皮和粗枝皮［1］。在我國肉桂主要分布于廣西、廣東，全國肉桂的種植面積約27萬公頃，產(chǎn)量占世界的38.1%［2］，而廣西、廣東兩省肉桂產(chǎn)量占我國肉桂產(chǎn)量的95%以上［3］。原花青素屬黃酮類物質(zhì)，以兒茶素、表兒茶素及其取代物為結(jié)構(gòu)單元［4］，按聚合度可分為低聚體和多聚體，其中五聚體以上稱為多聚體。原花青素主要以多聚體的形式存在，而原花青素低聚體在抗氧化、抗突變等方面有更加顯著的效果［5］。因此將多聚體片段化為低聚體，能大大提高原花青素的利用率。原花青素多為黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元通過C4～C8或/和C4～C6的鍵合方式構(gòu)成的“直鏈型”結(jié)構(gòu)。通過C4～C8或C4～C6連接鍵的酸催化裂解實現(xiàn)原花青素片段化是原花青素片段化最重要的化學反應(yīng)之一。在適當?shù)乃嵝詶l件下連接鍵易發(fā)生斷裂，末端的黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元(CAT或EPC等)被釋放出來的同時，另一結(jié)構(gòu)片斷(延伸單元)中C環(huán)4位形成的碳正離子易被適當?shù)挠H核試劑捕捉，從而形成親核試劑附加產(chǎn)物［6］。

原花青素多聚體(PPC)片段化的常用方法為硫醇法和間苯三酚法，主要使用芐硫醇和間苯三酚等親核試劑［7］。但上述方法在反應(yīng)中使用甲醇等有機溶劑、反應(yīng)時間過長、親核試劑使用量過大、需要高壓設(shè)備，且產(chǎn)物的活性評價僅停留在體外實驗階段以及得到的片段化產(chǎn)物需要進行安全性評價，因此至今仍局限于實驗室研究使用階段，難以進行產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。如果將食品來源的茶多酚應(yīng)用到PPC片段化反應(yīng)中，并且使反應(yīng)后低聚體和多聚體分開，以提高低聚體的含量，使原花青素低聚體(OPC)能夠進一步在醫(yī)藥品、保健品、食品添加劑、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用。因此本研究采用廣西肉桂為原料提取原花青素，運用茶多酚對PPC進行片段化，以片段化反應(yīng)后低聚體含量以及低聚體中原花青素含量為指標，通過單因素試驗考察片段化反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、鹽酸體積分數(shù)和多聚體與茶多酚物料比對反應(yīng)的影響，并采用正交試驗確定片段化反應(yīng)的最佳條件。

1 實驗

1.1 原料、試劑與儀器

廣西肉桂粉末(0.078～0.178 mm)，無水乙醇、甲醇、香草醛、鹽酸(分析純，上海國藥集團有限公司)，大孔吸附樹脂HP-20(北京慧德易科技有限責任公司)，TU-1810DASPC型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、Agilent 1200series高效液相色譜儀、BS-100A自動部分接收器。

1.2 肉桂原花青素多聚體的制備

稱取30 g肉桂粉末于1 000 mL三口燒瓶中，再向三口燒瓶中加入500 mL體積分數(shù)60%的乙醇，置于預(yù)熱的50℃恒溫水浴鍋中，安裝好冷凝管、磁力攪拌器，啟動攪拌裝置提取1.5 h，隨后取出燒瓶并冷卻至室溫，過濾后，濾液利用石油醚萃取，萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45±5℃減壓干燥，得到3 000 mg干燥原花青素初提物。

將3 000 mg干燥原花青素初提物溶解在少量體積分數(shù)60%的乙醇中，制得的濃溶液勻速加入吸附柱中，依次用體積分數(shù)40%、100%的乙醇溶液進行梯度洗脫，將原花青素低聚體、多聚體分開，此部分另有文獻報道［8］。

1.3 肉桂原花青素多聚體的片段化反應(yīng)

1.3.1片段化反應(yīng)條件 肉桂原花青素片段化反應(yīng):稱取40 mg茶多酚以及一定質(zhì)量的肉桂原花青素多聚體，置于15 mL含有0.01 mol/L Vc的一定體積分數(shù)的鹽酸溶液中，充分溶解，于一定溫度的恒溫水浴中反應(yīng)一定時間后置于室溫冷卻以終止反應(yīng)。片段化反應(yīng)液通過HP-20樹脂柱(1.5 cm×60 cm)吸附，首先用50 mL蒸餾水洗脫，以去除Vc以及鹽酸等小分子物質(zhì)，然后用體積分數(shù)40%的乙醇洗脫反應(yīng)產(chǎn)物中的低聚體，再用無水乙醇洗脫剩余的多聚體［8］。測定低聚體含量及低聚體中原花青素的含量。

1.3.2低聚體含量測定 低聚體、多聚體溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45±5℃減壓濃縮，得到低聚體、多聚體樣品，并稱質(zhì)量。利用式(1)計算低聚體含量。

式中:y1—低聚體含量，%;m1—低聚體質(zhì)量，mg;m2—多聚體質(zhì)量，mg。

1.3.3低聚體中原花青素含量測定 利用香草醛-鹽酸法測定原花青素的含量［9］，配制0.2 g/L的低聚體甲醇溶液，取0.5 mL低聚體甲醇溶液加入10 mL比色管中，依次加入3 mL質(zhì)量濃度為40 g/L的香草醛-甲醇溶液，1.5 mL濃鹽酸，加塞搖勻，在20±1℃避光條件下反應(yīng)15 min后，于500 nm處測其吸光度。利用(+)-兒茶素標準品建立標準曲線，稱取10 mg(+)-兒茶素標準品，甲醇溶解定容至25 mL，質(zhì)量濃度為0.4 g/L，混勻(避光保存)。分別取0、2、4、6、8、10 mL至10 mL比色管中，甲醇定容至10 mL，質(zhì)量濃度分別為 0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.4 g/L。在上述條件下反應(yīng)并測定吸光度，以此繪制(+)-兒茶素標準曲線，得擬合回歸線性方程:y=353.516 2x－14.230 8，R2=0.999 6，式中:x—(+)-兒茶素質(zhì)量濃度，g/L;y—吸光度。利用標準曲線計算得到低聚體甲醇溶液中原花青素質(zhì)量濃度，并利用公式(2)算出低聚體中原花青素含量。

式中:y2—低聚體中原花青素含量，%;c1—低聚體甲醇溶液中原花青素質(zhì)量濃度，g/L;v1—低聚體甲醇溶液體積，mL;m1—稱取低聚體質(zhì)量，mg。

1.3.4單因素試驗 以片段化反應(yīng)后低聚體含量和低聚體中原花青素含量為評價標準，考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、鹽酸體積分數(shù)、多聚體與茶多酚物料比對肉桂原花青素片段化反應(yīng)的影響。

1.3.5正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗設(shè)計，以片段化反應(yīng)后低聚體含量和低聚體中原花青素含量為指標，選擇片段化反應(yīng)中適宜的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、鹽酸體積分數(shù)、多聚體與茶多酚物料比，擬定4因素3水平進行L9(34)正交試驗設(shè)計，并對結(jié)果進行分析，求出片段化反應(yīng)最佳條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 片段化反應(yīng)單因素試驗結(jié)果

選用茶多酚對原花青素多聚體(PPC)進行片段化研究，以期建立一種環(huán)境友好型片段化方法。在以往的研究中多采用某種單體的含量為指標對片段化反應(yīng)條件進行優(yōu)化，但是單體含量較低，無法真正反映出片段化反應(yīng)程度，因此在該方法得到的最優(yōu)條件下反應(yīng)，無法得出片段化反應(yīng)后低聚體含量，因而不利于工業(yè)上大量生產(chǎn)原花青素低聚體。本研究利用先前研究結(jié)果［8］，利用大孔吸附樹脂HP-20分離原花青素，對吸附在樹脂上的原花青素進行梯度洗脫，用體積分數(shù)40%的乙醇洗脫得到的原花青素聚合度在2～4，可以認為主要是低聚體，用體積分數(shù)100%的乙醇洗脫得到的原花青素聚合度在5以上，可以認為主要是多聚體。因此利用大孔吸附樹脂HP-20對片段化反應(yīng)產(chǎn)物進行分離，將反應(yīng)后產(chǎn)物中的低聚體和多聚體分開，以片段化反應(yīng)后低聚體含量和低聚體中原花青素含量為指標，探索片段化反應(yīng)的最佳工藝條件。

2.1.1反應(yīng)溫度的影響 在多聚體與茶多酚物料比1∶1，鹽酸體積分數(shù)1%，反應(yīng)時間60 min的條件下，考察反應(yīng)溫度對片斷化反應(yīng)的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知，片段化反應(yīng)后低聚體含量以及低聚體中原花青素含量均隨溫度的升高先增加后降低，在60℃時達到最大值，之后，隨著反應(yīng)溫度的升高而急劇下降，故選擇60℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.1.2反應(yīng)時間的影響 選擇反應(yīng)溫度60℃，其他條件同2.1.1節(jié)，反應(yīng)時間對片段化反應(yīng)的影響結(jié)果如表1所示。由表1可知，片段化反應(yīng)后低聚體含量以及低聚體中原花青素含量均隨反應(yīng)時間的增加先升高后降低，在60 min時達到最大值，之后，隨著時間的升高而緩慢下降，故選擇60 min為最佳反應(yīng)時間。

表1 單因素試驗結(jié)果分析Table 1 Results of single factor experiment

2.1.3鹽酸體積分數(shù)的影響 選擇反應(yīng)溫度60℃，其他條件同2.1.1節(jié)，鹽酸體積分數(shù)對片段化反應(yīng)的影響結(jié)果如表1所示。由表1可知，片段化反應(yīng)后低聚體含量以及低聚體中原花青素含量均隨鹽酸體積分數(shù)的升高先升高后降低，在1%時達到最大值，之后，鹽酸體積分數(shù)在1% ～3%范圍內(nèi)，急劇下降，在大于3%以后，緩慢下降。故選擇1%為最佳鹽酸體積分數(shù)。

2.1.4多聚體與茶多酚物料比的影響 選擇反應(yīng)溫度60℃，其他條件同2.1.1節(jié)，多聚體與茶多酚物料比對片段化反應(yīng)的影響結(jié)果如表1所示。由表1可知，多聚體與茶多酚物料比在1∶4～1∶1之間片段化反應(yīng)后低聚體含量以及低聚體中原花青素含量隨多聚體與茶多酚物料比的升高而急劇升高，在1∶1時達到最大值，之后，多聚體與茶多酚物料比在1∶1～4∶1隨著物料比的升高而緩慢下降，故選擇1∶1為最佳多聚體與茶多酚物料比。

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，擬定4因素3水平，按L9(34)正交試驗設(shè)計表進行正交試驗，結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

從表2中極差分析可以看出:以片段化反應(yīng)后低聚體含量為指標各因素對肉桂原花青素片段化反應(yīng)的影響次序為:C＞D＞A＞B，各因素的最佳水平組合為A3B2C2D3，即反應(yīng)溫度為60℃、反應(yīng)時間為60 min、鹽酸體積分數(shù)為1%、多聚體與茶多酚物料比為1∶1。以低聚體中原花青素含量為指標各因素對肉桂原花青素片段化反應(yīng)的影響次序為:C＞D＞A＞B，各因素的最佳水平組合為A2B3C2D3，即反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為90 min、鹽酸體積分數(shù)為1%、多聚體與茶多酚物料比為1∶1。

2組結(jié)果中影響因素的主次順序相同，說明試驗所選因素恰當。綜合2個指標，在使原花青素多聚體片段化達到一定程度的同時，又能減少原花青素片段化成本，確定片段化反應(yīng)的最佳工藝條件:A2B2C2D3，即:反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為60 min、鹽酸體積分數(shù)為1%、多聚體與茶多酚物料比為1∶1。

2.3 片段化反應(yīng)驗證試驗

在最佳片段化反應(yīng)條件下進行3次驗證性試驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，片段化反應(yīng)后低聚體平均含量為65.26%，低聚體中原花青素平均含量為75.28%，說明該工藝條件有一定的可靠性和穩(wěn)定性。

表3 驗證性試驗結(jié)果Table 3 The results of stability test

3 結(jié)論

3.1 采用食物來源的茶多酚為親核試劑對肉桂中原花青素多聚體(PPC)進行片段化反應(yīng)，采用大孔吸附樹脂HP-20對片段化反應(yīng)產(chǎn)物進行分級處理，使低聚體從片段化反應(yīng)產(chǎn)物中分離出來。

3.2 以片段化反應(yīng)后原花青素低聚體含量以及低聚體中原花青素含量為指標，通過單因素試驗和正交試驗可以得到，各因素對肉桂原花青素片段化反應(yīng)的影響次序為:鹽酸體積分數(shù)＞多聚體與茶多酚物料比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間。

3.3 最佳工藝條件為反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為60 min、鹽酸體積分數(shù)為1%、多聚體與茶多酚物料比為1∶1，在此條件下進行片段化反應(yīng)重復(fù)驗證試驗，片段化反應(yīng)后低聚體含量為65.26%，低聚體中原花青素含量為75.28%。

［1］黃彪，劉雁，陳彥，等.超臨界二氧化碳提取肉桂精油的研究［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2003，23(1):59－62.

［2］劉永華.國內(nèi)外肉桂生產(chǎn)概況［J］.農(nóng)家之友，2001(10):11.

［3］陳家源，牙啟康，盧文杰，等.中藥肉桂的研究概況［J］.廣西醫(yī)學，2009，31(6):872－874.

［4］賈佳，楊磊，祖元剛.落葉松樹皮原花青素的勻漿提取及響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2009，29(3):78－84.

［5］姜貴全，方桂珍，龐久寅.地榆根提取低聚原花青素的研究［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2007，27(S1):129－132.

［6］HEMINGWAY R W.Reactions at the interflavonoid bond of proanth ocyanidins［M］∥HEMINGWAY R W，KARCHESY J J，BRANHAM S J.Chemistry and Significance of Condensed Tannins.New York:Plenum Press，1989，265.

［7］TORTES J L，LOZENO C，JULIA L.Cysteinyl-flavan-3-ol conjugates from grape procyanidins.Antioxidant and antiproliferative properties［J］.Bioogranic ＆ Medicinal Chemistry，2002，10(8):2497－2509.

［8］姜倩，張加研，秦永劍，等.大孔吸附樹脂HP-20分離肉桂原花青素的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，31(1):10919－10921.

［9］趙平，宋學娟，張月萍，等.葡萄籽原花青素含量測定［J］.河北化工，2007，30(1):46－48.