任亮 于淼 黃林 王鵬非 金素鈺 鄭玉才
摘要:采用毛細(xì)管電泳(CE)測(cè)定不同年齡的九龍牦牛背最長(zhǎng)肌中肌苷酸(IMP)含量,以闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡的變化規(guī)律。高氯酸法提取3歲、5歲和7歲公牦牛以及12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中的IMP,然后用CE測(cè)定。結(jié)果表明,樣品中IMP能在15 min內(nèi)獲得有效分離,且線性關(guān)系良好。3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量(1.46±0.14) mg/g分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛;12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量(1.18±0.36) mg/g顯著低于3歲公牦牛(P<0.05),與5歲、7歲的公牦牛相比差異不顯著。牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與年齡有關(guān),并為確定九龍牦牛肉最佳屠宰年齡提供了一定的依據(jù)。
關(guān)鍵詞:牦牛肉;毛細(xì)管電泳;肌苷酸
中圖分類號(hào):TS251.5+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)10-2480-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.047
牦牛(Bos grunniens)是青藏高原特有牛種,其肉具有高蛋白、低脂肪、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn),屬于優(yōu)質(zhì)綠色肉類資源。肌苷酸(IMP)又名次黃嘌呤核苷酸,是肉中重要的鮮味物質(zhì)之一。準(zhǔn)確測(cè)定牦牛肉中的IMP含量對(duì)于了解牦牛肉的風(fēng)味具有實(shí)際價(jià)值。目前,測(cè)定肉中肌苷酸主要采用高效液相色譜法(HPLC)[1]。毛細(xì)管電泳(CE)是近幾十年發(fā)展起來(lái)的新分析方法,具有快速、靈敏、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),較之HPLC操作步驟更簡(jiǎn)單,成本更低。目前,國(guó)內(nèi)外已有CE分析核苷酸的報(bào)道[2,3]。CE分析核苷酸含量容易受pH、緩沖液濃度等因素的影響。本研究建立并優(yōu)化了CE分析牦牛肌肉中IMP含量的方法,通過(guò)檢測(cè)不同年齡九龍牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量,闡明九龍牦牛肉中IMP隨年齡變化的規(guī)律,為確定九龍牦牛產(chǎn)肉的最佳屠宰年齡提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
選擇四川省甘孜州天然放牧的3歲、5歲和7歲九龍牦牛公牛,以及12歲九龍牦牛母牛各8頭,屠宰時(shí)采集背最長(zhǎng)肌,-80 ℃保存待用。
肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司);磷酸二氫鉀(分析純,成都市科龍化工試劑廠);四硼酸鈉(分析純,西安化學(xué)試劑廠)。
1.2 儀器
P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司),配有二極管陣列檢測(cè)器;Z323K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HermLe公司);DELEA 320 pH計(jì)(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝科器研究所);WH-3微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠) ;WPA Biowave II 分光光度計(jì)(英國(guó)Biochrom公司);OMNI-GLH電動(dòng)勻漿器(美國(guó)OMNI公司)。
1.3 方法
1.3.1 前處理 采用高氯酸法[1],準(zhǔn)確稱取0.100 g背最長(zhǎng)肌,加入0.6 mol/L高氯酸2 mL,用電動(dòng)勻漿器勻漿2次,每次15 s,冰上放置5 min后以12 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL,加入423 μL的1 mol/L KOH溶液,混合后以10 000 r/min于4 ℃離心10 min。上清液用0.45 μm水性膜過(guò)濾,4 ℃保存?zhèn)溆谩?.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 稱取肌苷酸0.010 0 g溶于10 mL去離子水中,滴入少許1 mol/L KOH溶液助溶,其準(zhǔn)確濃度采用分光光度法測(cè)定[4]。采用pH 5.5(磷酸調(diào)節(jié))緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至10~160 μg/mL系列梯度,并用0.45 μm水性膜過(guò)濾,待測(cè)。
1.3.3 分析條件 電泳條件主要參照文獻(xiàn)[5],并做部分調(diào)整[6-9]:毛細(xì)管柱為Beckman非涂層毛細(xì)管(57 cm×50 cm,75 μm)。緩沖液為50 mmol/L KH2PO4與50 mmol/L Na2B4O7等體積混勻,磷酸調(diào)節(jié)至pH 6.5,0.45 μm水性膜過(guò)濾,4 ℃保存?zhèn)溆?。使用前超聲脫?0 min。參數(shù)設(shè)定:柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm。毛細(xì)管在每次進(jìn)樣前分別用0.1 mol/L的NaOH和去離子水沖洗5 min,再用運(yùn)行緩沖液沖洗10 min,檢測(cè)完成后再用去離子水沖洗10 min,組分定性參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。
1.3.4 精密度檢驗(yàn) 將同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算保留時(shí)間與峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
2 結(jié)果與分析
2.1 肌苷酸(IMP)標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳分析
標(biāo)準(zhǔn)品IMP的保留時(shí)間約為13 min(圖1),峰形良好,峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間具有較好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 227.9x-2 136.5,在10~160 μg/ mL范圍內(nèi)R2為 0.997 6;最小檢出限(S/N=3)為1 μg/mL;分析方法具有良好的精密度,IMP保留時(shí)間RSD為1.3%,峰面積RSD為2.4%。
2.2 牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量
樣品的色譜圖見(jiàn)圖2,色譜峰對(duì)稱性好。分析表明,3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量分別極顯著和顯著高于5歲、7歲的公牦牛,而5歲與7歲牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP的含量差異不顯著(表1);12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量為(1.18±0.36) mg/g,顯著低于3歲公牦牛(P<0.05),與5、7歲的公牦牛相比差異不顯著。
3 小結(jié)與討論
試驗(yàn)結(jié)果中不同年齡公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量(表1)均低于魏雅萍等[10]、付永等[11]用HPLC測(cè)定的1.5歲公牦牛肋骨間最長(zhǎng)?。↙D)中IMP的含量分別為2.06 mg/g和2.38 mg/g。有研究報(bào)道,海門公山羊同一個(gè)體中不同部位的肌肉中IMP含量差異不顯著[12]。因此,牦牛肉中肌苷酸含量的差異可能主要源于試驗(yàn)牦牛的年齡不同[13]。另外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同飼養(yǎng)條件下,3歲公牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量(1.46 mg/g)極顯著高于5歲公牦牛(1.03 mg/g),說(shuō)明牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與年齡有關(guān)。由于動(dòng)物肌肉中IMP含量還受飼養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)和品種等多種因素的影響[13-16],因此,牦牛肉中肌苷酸含量還可能受到牧草的季節(jié)性變化等因素的影響。本研究中12歲母牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與5歲和7歲公牦牛接近,提示在該年齡階段,母牦牛肉仍保持較好的鮮味。馬旺等[6]、趙國(guó)芬等[17]測(cè)定了不同畜禽肌肉中的肌苷酸含量,豬肉(1.55 mg/g)、牛肉(1.2 mg/g)、雞肉(1.81 mg/g)、鴨肉(1.26 mg/g)、山羊(1.74 mg/g)。同各畜禽相比,3歲九龍牦牛肉中IMP含量(表1)高于鴨肉和普通牛肉,而5歲九龍牦牛肉中IMP含量(表1)低于其他肉類。因此,就IMP對(duì)肉鮮味的貢獻(xiàn)而言,九龍牦牛肉與普通牛肉大致相當(dāng)。
本試驗(yàn)采用HPLC法的肌肉樣品前處理技術(shù),通過(guò)優(yōu)化CE分析條件,建立了牦牛肉中IMP方法的CE分析方法。由于CE法中的毛細(xì)管成本低于HPLC色譜柱,且進(jìn)樣量少、操作簡(jiǎn)單,結(jié)果重現(xiàn)性好,線性范圍廣,表明該方法具有具有較大的應(yīng)用潛力。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牦牛背最長(zhǎng)肌中IMP含量與其年齡有關(guān),該結(jié)果可對(duì)牦牛最佳屠宰年齡提供參考。
參考文獻(xiàn):
[1] 王翠麗,王 永,鄭玉才,等.山羊、藏系綿羊和黃牛肉中肌苷酸含量的比較[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(11):2859-2863.
[2] SHAO X,O'NEILL K,ZHAO Z,et al. Analysis of nucleotide pools in human lymphoma cells by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A,1994,680(2):463-468.
[3] 杜建中,曾秀文,黃少春,等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定增味劑中的5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥(niǎo)苷酸二鈉的含量[J].食品工業(yè)科技,2010, 31(12):335-337.
[4] GILL B D,INDYK H E. Development and application of a liquid chromatographic method for analysis of nucleotides in milk and infant formulas[J]. IntDairy J, 2007,17(6):596-605.
[5] UHROV?魣 M,DEYL Z,SUCH?魣NEK M. Separation of commom nucleotides, mono-,di- and triphosphates,by capillary electrophoresis[J].J Chromatogr B,1996,681(1):99-105.
[6] 馬 旺,蔡?,摚T華榮,等.畜禽肌肉中肌苷酸測(cè)定的高效毛細(xì)管電泳法研究[J].食品科學(xué),2009,30(6):180-183.
[7] SUSAN E,GELDART,PHYLLIS R,BROWN.Analysis of nucleotides by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogram A,1998,828(1-2):317-336.
[8] YEH C F,JIANG S J.Determination of monophosphate nucleotides by capillary electrophoresis inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Analyst,2002,127(10):1324-1327.
[9] LIU C C,HUANG J S,TYRRELL D L,et al. Capillary electrophoresis-electrospray-mass spectrometry of nucleosides and nucleotides: Application to phosphorylation studies of anti-human immunodeficiency virus nucleosides in a human hepatoma cell line[J]. Electrophoresis,2005,26(7-8):1424-1431.
[10] 魏雅萍,丁鳳煥,徐驚濤,等.牦牛、犏牛及黃牛肉脂肪酸和風(fēng)味物質(zhì)的分析[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2009,39(5):1-4.
[11] 付 永,魏雅平,孟 茹.牦牛、犏牛和黃牛生產(chǎn)性能、肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的比較[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2013,25(11):2734-2740.
[12] 謝愷舟,陳書(shū)琴,李洋靜,等.海門山羊羊肉中肌苷酸與肌內(nèi)脂肪沉積規(guī)律的研究[J].遺傳育種,2011,47(23):18-21.
[13] 周小娟,朱年華,張日俊.品種、日齡及飼養(yǎng)方式對(duì)肌肉肌苷酸和肌內(nèi)脂肪含量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(5):1251-1256.
[14] 李慧芳,陳寬維.不同雞種肌肉肌苷酸和脂肪酸含量的比較[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(3):9-11.
[15] 方 燕,過(guò)世東.棚養(yǎng)和塘養(yǎng)甲魚(yú)肌肉中呈味核苷酸的含量變化及比較[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006,27(8):17-22.
[16] 陳 寧,尹君亮,李國(guó)慶,等.不同營(yíng)養(yǎng)調(diào)控劑對(duì)牛肉中肌苷和肌苷酸含量的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2009,30(1):65-67.
[17] 趙國(guó)芬,敖長(zhǎng)金,趙志恭,等.沙蔥和油籽對(duì)羊肉肌苷酸和腺苷酸含量的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2007,22(1):164-166.