苦參素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制

史衛(wèi)林，李堅(jiān)，陸建保，陳萍，周玉濤

（1.溧陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇溧陽213300；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

苦參素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制

史衛(wèi)林1，李堅(jiān)2，陸建保1，陳萍2，周玉濤1

（1.溧陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇溧陽213300；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：觀察苦參素聯(lián)合放射線照射對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖率以及DNA依賴性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）的兩類結(jié)構(gòu)亞基DNA-PKcs及Ku80 mRNA表達(dá)的影響。方法根據(jù)不同的處理?xiàng)l件，將A549細(xì)胞分為對(duì)照組，單純照射組，單純藥物組，藥物聯(lián)合照射組。通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果：苦參素明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，呈時(shí)間和劑量依賴性（P＜0.05），其24 h和48 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為3.2 g/L和2.4 g/L。單純照射組隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)和放射線劑量的增加，細(xì)胞增殖率明顯下降（P＜0.05）；藥物聯(lián)合照射組細(xì)胞隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率也隨之明顯下降（P＜0.05）；在同一時(shí)間點(diǎn)，藥物聯(lián)合照射組細(xì)胞增殖率下降比單純照射組更為明顯（P＜0.05）。此外，在單純照射組中，A549細(xì)胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)和放射線劑量的增加而增高（P＜0.01）；較對(duì)照組而言，單純藥物組DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）；與對(duì)應(yīng)的單純照射組比較，藥物聯(lián)合照射組DNA-PKcs及Ku80 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論：苦參素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有放射線增敏作用。輻射可明顯增加肺癌細(xì)胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，苦參素對(duì)A549細(xì)胞的放射線增敏效應(yīng)至少部分是與抑制DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表達(dá)，從而抑制DNA損傷修復(fù)有關(guān)。

肺癌；苦參素；放射敏感性；DNA依賴性蛋白酶

放療是中晚期肺癌患者的一個(gè)重要治療手段。腫瘤細(xì)胞受到放射線照射后主要發(fā)生堿基損傷、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等損傷，其中最主要是雙鏈斷裂，而細(xì)胞可以修復(fù)雙鏈斷裂從而對(duì)放射線產(chǎn)生放療耐受?，F(xiàn)有研究認(rèn)為DNA依賴性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）通過修復(fù)雙鏈斷裂，影響細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性［1］。DNA-PKcs及Ku80是DNA-PK的結(jié)構(gòu)亞基，參與DNA非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)，是研究腫瘤細(xì)胞放療敏感性的重要靶點(diǎn)。近年來，雖然腫瘤放療技術(shù)已取得較大進(jìn)展，但仍有部分患者放射治療失敗。而且對(duì)放射治療有效的患者復(fù)發(fā)后再放療效果常常不明顯，究其原因主要與腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線耐受有關(guān)?？鄥⑺厥侵兴幙鄥⒌闹饕钚猿煞种?，具有放療增敏作用［2］，但機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察苦參素聯(lián)合放射線照射對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖率以及DNA-PKcs、Ku80 mRNA表達(dá)的影響，探討苦參素放療增敏的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），苦參素標(biāo)準(zhǔn)品（北京中科儀友化工技術(shù)研究院），CCK-8試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司），Trizol試劑盒（美國(guó)Invitriogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），倒置式生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Clinac 600c 6MV直線加速器（美國(guó)Varian公司），HT-2型酶標(biāo)儀（Austria公司），熒光定量PCR分析儀（美國(guó)Stratagene公司），人肺腺癌A549細(xì)胞株由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 苦參素作用于A549細(xì)胞后細(xì)胞增殖率的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種至96孔板，每孔100μL（細(xì)胞數(shù)約5×103/孔），每一實(shí)驗(yàn)組（按苦參素濃度）設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后移液槍小心吸取上清液，分別將含有苦參素質(zhì)量濃度為0，0.5，1.0，2.0以及4.0 g/L的培養(yǎng)基100μL加入對(duì)應(yīng)的孔中，其中0 g/L設(shè)為陰性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)立空白組。然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在培養(yǎng)24 h和48 h后于對(duì)應(yīng)的各孔中加CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)于37℃恒溫條件下培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處光密度（D）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用空白組調(diào)零后，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率（細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值×100%）。

1.3 單純照射和藥物聯(lián)合放射線作用后細(xì)胞增殖率的測(cè)定

根據(jù)細(xì)胞抑制率，利用SPSS 17.0軟件計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC50）值，選擇48 h 20%抑制濃度（IC20）值0.9 g/L作為加藥濃度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為對(duì)照組，單純照射組，藥物聯(lián)合照射組，照射劑量分為1，2，4和8 Gy。在24 h和48 h分別測(cè)定細(xì)胞增殖率，測(cè)定方法同上。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為對(duì)照組，單純照射組，單純藥物組，藥物聯(lián)合照射組，照射劑量分為1，2，4和8 Gy，單純藥物組與藥物聯(lián)合照射組中苦參素質(zhì)量濃度選定為0.9 g/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，接種細(xì)胞，在藥物及射線干預(yù)后的24，48 h收集細(xì)胞，使用Trizol試劑提取RNA，測(cè)定RNA濃度，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃5 min預(yù)變性，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH：上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度172 bp；DNA-PKcs：上游引物5′-ATCTGTCATCTGCTGTGTCTTCAAT-3′，下游引物5′-CTGCTTCTCTGGCTTCTTTCCTAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度197 bp。Ku80：上游引物5′-GCTAATCCTCAAGTCGGCGT-3′，下游引物5′-ATGGAGTCAATCAAAGCATCAACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度182 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，定量分析DNAPKcs及Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。目的基因相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算公式：2-ΔΔCt=2-（ΔCt目的基因-ΔCt標(biāo)準(zhǔn)值）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 苦參素對(duì)A549細(xì)胞增殖率的影響

不同質(zhì)量濃度的苦參素處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率隨苦參素作用時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的增大而下降，呈時(shí)間（P＜0.05）和劑量依賴性（P＜0.05）。4種質(zhì)量濃度的苦參素作用后細(xì)胞的增殖率見圖1。24 h的IC50值為3.2 g/L，48 h的IC50值為2.4 g/L，48 h的IC20值為0.9 g/L。

圖1 不同質(zhì)量濃度苦參素作用后A549細(xì)胞的增殖率

2.2 單純照射和藥物聯(lián)合照射處理對(duì)A549細(xì)胞增殖率的影響

如圖2所示，當(dāng)藥物聯(lián)合照射組中苦參素質(zhì)量濃度設(shè)定為0.9 g/L時(shí)，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)和照射劑量的增加，單純照射組和藥物聯(lián)合照射組的A549細(xì)胞增殖率明顯下降（P＜0.05）；在同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)應(yīng)的照射組比較，藥物聯(lián)合照射組的細(xì)胞增殖率明顯下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，苦參素可明顯增加A549細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。

圖2 不同放射線劑量對(duì)兩組A549細(xì)胞增殖率的影響

2.3 單純照射和藥物聯(lián)合照射作用后A549細(xì)胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

與對(duì)照組（對(duì)照組中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表達(dá)量設(shè)定為1）比較，單純照射組DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和照射劑量的增加明顯增高（P＜0.01），見表1、表2。單純藥物組的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）；在同一時(shí)間及同一放射線劑量，藥物聯(lián)合照射組的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較單純照射組顯著降低（P＜0.01），見表3、表4。結(jié)果提示，放射線可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞DNA-PKcs和Ku80基因表達(dá)的增加，而苦參素可下調(diào)A549細(xì)胞的DNA-PKcs和Ku80 mRNA表達(dá)水平。

表1 4種劑量X射線處理后A549細(xì)胞DNA-PKcsm RNA的相對(duì)表達(dá)水平

表2 4種劑量X射線處理后A549細(xì)胞Ku80 m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

表3 5種劑量X-射線聯(lián)合苦參素（0.9 g/L）處理后A549細(xì)胞DNA-PKcsmRNA的相對(duì)表達(dá)水平

表4 5種劑量X射線聯(lián)合苦參素（0.9 g/L）處理后A549細(xì)胞Ku80 m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

苦參素（氧化苦參堿）來源于豆科植物苦參的干燥根，是中藥苦參的主要生物堿。近年來研究發(fā)現(xiàn)，苦參素有多方面的藥理活性，其中抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。它能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤新生血管形成和腫瘤侵襲［3-8］。也有少量報(bào)道表明其有放療增敏作用［2］，但機(jī)制不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參素能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，這一作用呈時(shí)間和劑量依賴性。而且與單純照射組比較，苦參素聯(lián)合照射組的A549細(xì)胞增殖率明顯降低，表明苦參素可增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。

DNA是放射線作用的主要靶點(diǎn)，放射線的直接作用和電離效應(yīng)產(chǎn)生的自由基共同導(dǎo)致DNA單、雙鏈斷裂損傷，其中以雙鏈斷裂為放射線殺傷腫瘤細(xì)胞最重要的機(jī)制。當(dāng)DNA雙鏈?zhǔn)艿綋p傷時(shí)，細(xì)胞將通過不同的途經(jīng)啟動(dòng)應(yīng)答進(jìn)行DNA修復(fù)以克服損傷。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，雙鏈斷裂修復(fù)有兩條途徑：同源性重組（homologous recombination，HR）和NHEJ，其中NHEJ途徑是主要修復(fù)途徑［9］。DNAPKcs基因位于染色體8q11，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為469 000的蛋白質(zhì)，其C-末端結(jié)構(gòu)域和參與信號(hào)傳導(dǎo)的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）有同源性［10］。人Ku80基因位于染色體2q33-34，編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為86 000的蛋白，參與DNA-PK與其他蛋白的相互作用，它與Ku70緊密結(jié)合，形成Ku蛋白［11］。當(dāng)DNA雙鏈損傷時(shí)，2個(gè)Ku分子特異性地連接到DNA雙鏈損傷處，分別識(shí)別并結(jié)合于每一條DNA鏈末端，然后以ATP依賴的方式沿DNA鏈分別向兩端滑動(dòng)一小段距離，同時(shí)Ku本身具有的弱解旋酶活性使兩個(gè)斷端局部解鏈，從而形成Ku-DNA復(fù)合物吸引DNA-PKcs到損傷部位，位于兩個(gè)斷裂末端的DNA-PK蛋白復(fù)合體通過各自的氨基端相互作用搭橋，拉近DNA損傷末端，并激活DNA-PKcs的絲/蘇氨酸激酶活性，磷酸化參與NHEJ的一系列蛋白質(zhì)，對(duì)DNA損傷位點(diǎn)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)募羟泻瓦B接，當(dāng)修復(fù)完成后DNA-PK發(fā)生自身磷酸化，使2個(gè)亞單位從DNA鏈上解離［12-13］。作為DNA-PK復(fù)合物的主要功能單位，DNA-PKcs與Ku80是研究腫瘤細(xì)胞放療敏感性的重要靶點(diǎn)。

大量研究顯示，DNA-PKcs和Ku80基因或者蛋白高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線耐受，而低表達(dá)則對(duì)放射線高度敏感［14-15］。有研究顯示，通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA-PKcs的表達(dá)或抑制其磷酸化，或者抑制Ku80的表達(dá)，均可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性［16-21］，說明DNA-PKcs和Ku80的表達(dá)水平是影響細(xì)胞對(duì)放射線敏感性的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純用放射線照射后隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，照射劑量的增強(qiáng)，肺腺癌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平相應(yīng)增加。這一結(jié)果表明，放射線在殺傷肺癌細(xì)胞的同時(shí)也誘導(dǎo)了DNA-PKcs和Ku80基因的表達(dá)增加，NHEJ通路的DNA損傷修復(fù)功能被激活，以抵抗放射線對(duì)肺癌細(xì)胞DNA的損傷作用，同樣證明了DNA-PKcs和Ku80在肺腺癌細(xì)胞對(duì)放療的耐受中起著重要作用，其表達(dá)水平可以作為預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)放療敏感性的標(biāo)志。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，單純藥物組中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，藥物聯(lián)合照射組與對(duì)應(yīng)的單純照射組相比較，其相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)，這也表明了苦參素可下調(diào)肺腺癌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku80的表達(dá)水平，通過抑制DNA的修復(fù)功能，增加細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，這也可能是其放療增敏機(jī)制之一。

綜上所述，苦參素具有放射線增敏作用，其增敏機(jī)制之一可能是通過下調(diào)DNA-PKcs和Ku80的表達(dá)，抑制細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)功能。苦參素放射線增敏作用的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of oxymatrine on radiosensitivity of A549 cells and its possiblemolecular mechanism

SHIWei-lin1，LI Jian2，LU Jian-bao1，CHEN Ping2，ZHOU Yu-tao1
（1.Department of Respiratory Medicine，the People′s Hospital of Liyang City，Liyang Jiangsu 213300；2.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the mechanism of oxymatrine in enhancing the sensitivity of lung cancer cells to radiation.M ethods：The A549 cellswere divided into control group，radiation group，drug group，drug plus radiation group according to treatment condition.The cell counting kit-8 assay was used to determine proliferation rate.The real-time quantitative PCR assays were conducted tomeasure DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression levels at 24 h and 48 h following treatment with oxymatrine，or radiation，or oxymatrine plus radiation.Results：Oxymatrine significantly inhibited the proliferation of A549 cells in a dose and time dependentmanner（both P＜0.05）.IC50of A549 cells for oxymatrine at24 h and 48 h were 3.2 g/L and 2.4 g/L，respectively.The proliferation rates of A549 cells in the radiation group were decreased in a time and dose dependentmanner（both P＜0.05）.At the same time points，the cell proliferation rates in the drug plus radiation group were dropped markedly when compared with the radiation group（P＜0.05）.Additionally，the relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80 mRNA were increased in a dose and time dependentmanner in the radiation group（both P＜0.01）.The relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80mRNA in the drug plus radiation group were reduced significantly as compared with inthe radiation group（P＜0.01）.Conclusion：Oxymatrine enhanced the sensitivity of A549 cell to radiation，at least partially，by inhibiting DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression and damage of DNA damage repairmechanisms.

lung cancer；oxymatrine；radiosensitivity；DNA dependent protein kinase

R734.1 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號(hào)］ 1671-7783（2015）03-0207-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150083

溧陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（溧科發(fā)［2013］5）；江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目（JLY20120116）

史衛(wèi)林（1982—），男，江蘇溧陽人，主治醫(yī)師，主要從事肺癌分子診斷研究。

2015-04-04 ［編輯］陳海林