文/林伯坤 喻玉立 邵軍麗 郭蓮仙 戴娟秀 黃明元

衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)是個(gè)涉及多學(xué)科知識(shí)的專業(yè)，主要包括理化檢驗(yàn)和生物相關(guān)檢驗(yàn)兩大方面的內(nèi)容。衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)學(xué)生多學(xué)科的實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)學(xué)生開(kāi)展科學(xué)研究的思維和能力，同時(shí)提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的重要補(bǔ)充。因此，綜合實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容需要滿足這些要求，尋找合適的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容具有重要意義。一般的微生物不能利用瓊膠，因此瓊膠在微生物實(shí)驗(yàn)中用作培養(yǎng)基載體，但是有些細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生瓊膠酶去利用降解瓊膠，這些細(xì)菌菌落在瓊膠固體培養(yǎng)基上形成透明降解圈，不需要碘液即可觀察，非常簡(jiǎn)便和有趣。瓊膠降解菌的相關(guān)研究 (篩選、鑒定和酶活測(cè)定等)涉及多個(gè)學(xué)科的實(shí)驗(yàn)技能，包括微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等，有利于提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)技能，具有適合于開(kāi)展綜合實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)。本文根據(jù)本科生特點(diǎn)和知識(shí)水平，對(duì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行了探討。

1.瓊膠降解菌的篩選

1.1 樣品采集

瓊膠降解菌在自然界中分布廣泛，除了海洋環(huán)境以外［1］，土壤［2－4］、河底沉積物［5］以及河水等環(huán)境中均可篩選得到瓊膠降解菌。因此，結(jié)合校園環(huán)境特點(diǎn)和就近原則，可選擇采集校園內(nèi)或周邊環(huán)境中的土壤、湖底/河底沉積物以及河水和湖水等樣品用作瓊膠降解菌的篩選。臨近海洋的校園，也可選擇采集海洋中的海藻、海水和海底沉積物等樣品?？刹蓸訕悠返亩鄻有允沟每梢詫?shí)行分組采樣，不同組采集不同的樣品。采樣前向?qū)W生強(qiáng)調(diào)對(duì)采樣相關(guān)容器和工具的滅菌處理，以確保菌株來(lái)源的準(zhǔn)確性。

1.2 菌株篩選

瓊膠降解菌的培養(yǎng)基會(huì)隨著樣品不同而不同。對(duì)于陸地環(huán)境樣品，一般采用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基，對(duì)于海洋環(huán)境樣品，一般采用2216E培養(yǎng)基。這一點(diǎn)內(nèi)容向?qū)W生灌輸了菌株篩選應(yīng)根據(jù)樣品而選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基的思想。

一般采取稀釋平板涂布法進(jìn)行瓊膠降解菌的菌株篩選，因此需要采用相應(yīng)的瓊膠固體培養(yǎng)基，這里的瓊膠不僅是因?yàn)橛糜谥谱鞴腆w培養(yǎng)基，同時(shí)也成為瓊膠降解菌的底物。瓊膠降解菌因可以產(chǎn)生瓊膠酶去降解瓊膠，會(huì)在瓊膠固體培養(yǎng)基上菌落周圍形成透明降解圈，降解圈大小代表著降解瓊膠的能力，肉眼可見(jiàn)，容易觀察，如果往瓊膠培養(yǎng)基中傾倒盧戈氏碘液，透明降解圈會(huì)更加明顯易見(jiàn)。容易觀察的瓊膠降解圈因此非常適合于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1.3 菌株的純化

挑選產(chǎn)生透明瓊膠圈的菌落進(jìn)行純化，加強(qiáng)學(xué)生在固體平板劃線分離純化菌株的技能訓(xùn)練，作出較美觀的劃線。

2.瓊膠降解菌的鑒定

2.1 菌株形態(tài)和細(xì)菌染色

首先觀察菌落形態(tài)和顏色，再用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)，最后進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，加強(qiáng)學(xué)生的顯微觀察技能的訓(xùn)練。

2.2 生理生化鑒定

選取常見(jiàn)的生理生化指標(biāo)進(jìn)行初步的鑒定，比如氧化酶、過(guò)氧化氫酶、糖類分解試驗(yàn)、溶血性檢查、凝固酶試驗(yàn)和抗生素抗性。條件允許情況下，可讓學(xué)生使用藥敏試驗(yàn)的自動(dòng)鑒定系統(tǒng)。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

總DNA提取:讓學(xué)生嘗試兩種總DNA提取方法，一種是傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑DNA提取法，一種是DNA提取試劑盒法。讓學(xué)生了解DNA提取試劑盒法的原理，比較兩種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量。

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增:雖然實(shí)驗(yàn)使用的16S rRNA基因的引物是直接購(gòu)買回來(lái)的通用引物 (27F和1492R)，但仍然有必要向?qū)W生講解引物設(shè)計(jì)的原理和16S rRNA基因通用引物的設(shè)計(jì)根據(jù)。這部分內(nèi)容使學(xué)生掌握PCR擴(kuò)增技術(shù)、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析以及回收純化技術(shù)。

PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析:將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，最終進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)得的16S rRNA基因序列提交EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)［6］與現(xiàn)有細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，或者在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果以及菌株形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果確定菌株的分類歸屬。如果所獲得基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列存在差異，即可讓學(xué)生將所測(cè)基因序列提交至Genbank，將會(huì)大大提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣［7］。

3.菌株的產(chǎn)酶檢測(cè)

將瓊膠降解菌培養(yǎng)在含有一定量瓊膠的液體培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生瓊膠酶至培養(yǎng)基中，通過(guò)用DNS測(cè)還原糖法測(cè)定培養(yǎng)液中的瓊膠酶活性，計(jì)算每毫升培養(yǎng)液所含的酶活單位，讓學(xué)生比較各自所篩選得到的菌株的產(chǎn)酶能力，既能加強(qiáng)學(xué)生的生物化學(xué)技能訓(xùn)練，又能提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

結(jié)論

瓊膠降解菌的相關(guān)研究 (篩選、鑒定和酶活測(cè)定等)涉及多個(gè)學(xué)科的實(shí)驗(yàn)技能，包括微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等，有利于提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)技能，且實(shí)驗(yàn)條件較易滿足，實(shí)驗(yàn)趣味性較好，有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，具有適合于衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)開(kāi)展綜合實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)。

［1］林伯坤，陸國(guó)永，宋燕，陳鴻霖，胡忠.海洋細(xì)菌Agarivorans sp.HZ105的瓊膠降解酶系.生物技術(shù)通報(bào)，2015，31(1):160－166.

［2］陳虹，張建芬，柯薇.一株瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離及產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化.食品科技，2014，(4):10－14.

［3］韓文君，古靜燕，李天東，等.一株產(chǎn)瓊膠酶土壤細(xì)菌Paenibacillus sp.MY03的篩選與分子鑒定.綿陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，26(2):86－90.

［4］Hosoda，A.，Sakai，M.Isolation of Asticcacaulis sp.SA7，a novel agar－degrading alphaproteobacterium.Biosci Biotechnol Biochem，2006，70:722－725.

［5］Rhee，Y.J.，Han，C.R.，Kim，W.C.，Jun，D.Y.，Rhee，I.K.，Kim，Y.H.Isolation of a novel freshwater agarolytic Cellvibrio sp.KY － YJ－ 3 and characterization of its extracellular β －agarase.J Microbiol Biotechnol，2010，20(10):1378 –1385.

［6］Kim，O.S.，Cho，Y.J.，Lee，K.，Yoon，S. H.，Kim，M.，Na，H.，Park，S.C.，Jeon，Y.S.，Lee，J.H.，Yi，H.，Won，S.，Chun，J.(2012).Introducing EzTaxon:a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.Int J Syst Evol Microbiol 62，716–721.

［7］侯進(jìn)慧.從淀粉酶產(chǎn)生菌篩選和基本鑒定談探究性實(shí)驗(yàn)教學(xué).微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(1):127－129.