王菁

摘要 建立了大菱鲆肌肉中羧甲基賴氨酸（CML）的氣相色譜質譜（GCMS）檢測方法。以大菱鲆為研究對象，選用三氯甲烷/丙酮對樣品進行脫脂，經硼氫化鈉還原、蛋白水解、凈化、衍生化（酯化與?；┖螅M行GCMS選擇離子監(jiān)測（SIM）模式檢測。選取m/z 392為定量離子，m/z 392， 365， 333， 305為定性離子。結果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面積與濃度在1～200 μg/L范圍內呈良好線性關系，方法檢出限為1 mg/kg， 定量限為5 mg/kg，3個加標水平（10， 150和350 mg/kg） 下的平均回收率在100%～104%之間，相對標準偏差RSD<5%（n=5）。

關鍵詞[HTSS]羧甲基賴氨酸； 大菱鲆； 氣相色譜質譜； 衍生化

1引言

晚期糖基化終末產物（Advanced glycation endproducts， AGEs）是食品中蛋白、脂質和核酸等組分在熱加工過程中發(fā)生非酶糖基化反應的產物[1]，其中羧甲基賴氨酸（Nεcarboxymethyllysine， CML）為主要標志性產物[2]。研究表明，食品中AGEs與心腦血管疾病、腎臟疾病、糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病有密切關系[3，4]。為更好地監(jiān)測其在食品中含量，建立靈敏可靠的檢測方法非常必要。

目前，關于食品中CML檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[1，5]、高效液相色譜法（HPLC） [6～8]、液相色譜質譜聯(lián)用法（LCMS）[9，10]等。ELISA法操作相對簡便，但假陽性率高，僅能得到CML相對值（kU/g）；HPLC法通過衍生化使CML具有熒光性并定量分析，但該具有熒光特性的衍生物不穩(wěn)定，導致結果偏差較大；LCMS具有良好的靈敏度，又避免了衍生化處理，但基質干擾帶來的離子抑制效應難以避免，且檢測成本昂貴 [11]。GCMS具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢，有望開發(fā)成有效的CML檢測方法。Amélie [12]等運用GCMS對食品中CML進行檢測，由于前處理、基質差異等原因，雖成功檢測到奶粉等產品中的CML，但未檢測到鮭魚中的CML。目前，尚未見水產品中CML確證檢測方法的報道。本研究以海水魚中重要養(yǎng)殖品種大菱鲆為研究對象，利用GCMS測定魚肉中CML含量，定量限由150 μg/L[12]降到5 μg/L，為水產品中CML檢測提供了技術參考。

2實驗方法

2.1儀器、試劑與材料

羧甲基賴氨酸（CML，純度98%，加拿大TRC公司）；二氯甲烷（色譜純，美國ACS公司）；三氟乙酸酐（色譜純，純度99%，北京百靈威科技有限公司）；氯化亞砜（色譜純，純度≥99.5%，天津科密歐試劑公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；其它試劑均為國產分析純。

大菱鲆購自青島南山水產市場，經“三去”處理后，取背部肌肉絞碎，分裝后，置于Symbolm@@ 18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2溶液配制

準確稱取10.00 mg CML于10.00 mL超純水，混勻，制成1 mg/mL標準貯備溶液，分裝后，于Symbolm@@ 18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制6 mol/L HCl、0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 9.2）、2 mol/L NaBH4（溶于0.1 mol/L NaOH）；取1.46 mL氯化亞砜緩慢加入100 mL甲醇中，制成衍生劑備用。

2.3樣品前處理

2.3.1脫脂準確稱取200.0 mg樣品于50 mL離心管，加入20 mL脫脂液，混勻，于4℃以4000 r/min離心15 min，棄上清液；再加入20 mL脫脂液，重復上述離心操作，棄上清液后以氮氣吹干，得蛋白沉淀。本研究選取正己烷[13]、水甲醇三氯甲烷[12]、三氯甲烷丙酮[14]3種脫脂液進行比較。

2.3.2硼氫化鈉還原為避免樣品中羰基化合物等經后續(xù)高溫蛋白水解進一步生成CML造成檢測結果偏大，向蛋白沉淀中添加2 mL硼酸鹽緩沖液和400 μL NaBH4溶液，混勻，于4℃反應8 h[15]。

2.3.3蛋白水解將還原后的蛋白沉淀轉移至10 mL安瓿瓶中，加入8 mL 6 mol/L HCl，充入氮氣后封瓶，于110℃烘箱水解，得到蛋白水解液。

3.3GCMS分析結果

為了將目標峰更好地辨別出來，采用程序升溫方法進行氣相色譜峰分離。在SCAN模式中（圖2a），因魚肉組織基質復雜，目標峰極易被復雜的干擾因素掩蓋，因此選用SIM模式對目標化合物進行檢測。根據標準品在SCAN模式下得到的質譜圖（圖3），選擇特征定量離子與定性離子（表2），得到的選擇離子流色譜圖（圖2b）無其它干擾峰，且峰型良好，信噪比顯著提高，利于目標化合物CML準確定量分析。

3.4方法評價

3.4.1線性范圍本方法采用外標法定量。準確稱取10.00 mg CML標準品于反應瓶中，按2.3.5節(jié)充分衍生化后，最終溶于10.00 mL二氯甲烷，制成標準貯備液，分裝后置于

Symbolm@@ 18℃貯存?zhèn)溆?。使用前用二氯甲烷稀釋，配制?， 5， 60， 80， 100， 150和200 μg/L的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。GCMS測定，以CML三氟乙酰甲酯化衍生物的定量離子峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標作圖，得到標準工作曲線（圖4）。結果表明，CML在濃度為1～200 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數>0.999。

3.4.2檢出限與定量限因大菱鲆肌肉中含有CML，所以通過稀釋樣品檢測液，測定信噪比（S/N），確定檢出限與定量限。

使用Agilent公司離線分析工作站軟件計算信噪比，選取RMS S/N作為譜圖信噪比參數[13]。當樣品檢測液RMS S/N=3時，根據檢測液濃度得出CML檢出限為1 mg/kg；當樣品檢測液RMS S/N=10時，根據檢測液濃度得出CML定量限為5 mg/kg。

3.4.3準確度與精密度在樣品中加入適量CML標準貯備溶液，制成10， 150和350 mg/kg的加標樣品，按照2.3和2.4節(jié)，以測得添加量和添加量之比計算回收率。每個添加水平做5組平行，根據得到的回收率計算相對標準偏差（RSD），評價精密度。

不加標大菱鲆肌肉樣品中約含有9.60 mg/kg的CML，選取10， 150和350 mg/kg作為加標水平，進行添加回收實驗，每個添加水平做5組平行，數據見表3。結果表明，CML在3個添加水平下的平均回收率在100%～104%之間，相對標準偏差RSD<5%。結果說明，本方法檢測大菱鲆肌肉中CML的準確度和精密度良好，符合生物樣品的檢測分析要求。

3.5樣品分析

為考察方法的適用性，使用本方法對市售即食水產品進行抽檢。檢測結果表明，所有即食水產品中均含有CML。其中CML在罐裝金槍魚中含量為（34.81±0.46） mg/kg，罐裝鯽魚中含量為（200.60±6.58） mg/kg，烤制魷魚絲中含量為（335.21±9.42） mg/kg。即食水產品中的CML含量遠高于生鮮大菱鲆，因即食水產品中含有糖、油等調味品，且經熱加工、高溫殺菌等處理過程，有利于非酶糖基化反應的進行，進而生成更多CML。

4結 論

本研究選用三氯甲烷丙酮為脫脂液，經NaBH4還原、蛋白水解后，對樣品進行衍生化，選用二氯甲烷為溶劑，采用SIM模式掃描，建立了大菱鲆肌肉中CML的GCMS檢測方法。與酶聯(lián)免疫方法相比，GCMS法避免了酶聯(lián)免疫法的假陽性，能夠更加準確地對魚類肌肉中的CML進行定性和定量分析，靈敏度更高，檢測結果易與其它方法進行比較，是檢測大菱鲆肌肉中CML含量的較好方法。

References

1Teresia G， Cai W J， Melpomeni P， Veronique D， Bantwal S B， Jaime U， Helen V. J. Am. Diet. Assoc.， 2004， 104（8）： 1287-1291

2Jennifer M A. New York Academy of Sciences， 2008， 1126： 20-24

3Jaime U， Sandra W， Susan G，Cai W J， Chen X， Renata P， Angie Y， Gary E S， Helen V. J. Am. Diet. Assoc.， 2010， 110（6）： 911-916

4Madhav M J， Shrimant N P， Akalpita U A. J. Funct. Foods， 2014， 6： 107-115

5Sun Z， Peng X F， Liu J， Fan K W， Wang M F， Chen F. Food Chem.， 2010， 120（1）： 261-267

6Drusch S， Faist V， Erbersdobler H F. Food Chem.， 1999， 65（4）： 547-553

7Chao P C， Hsu C C， Yin M C. Food Chem.， 2009， 113（1）： 262-266

8DelgadoAndrade C，Seiquer I， Navarro M P， Morales F J. Mol. Nutrit. Food Res.， 2007， 51（3）： 341-351

9George L H， Jayne V W， Jennifer M A， Geraldine J C. Food Chem.， 2012， 131（1）： 170-174

10Céline N L， Frédéric J T. Food Chem.， 2011， 126（2）： 655-663

11GAO Chang， HE ZhiYong， ZENG MaoMao， CHEN Jie. Chinese Journal of Food and Fermentation Industries， 2013， 39（4）： 151-156

高 暢， 何志勇， 曾茂茂， 陳 潔. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2013， 39（4）： 151-156

12Amélie C， Lamia A A， Inès B A. J. Chromatogr. A， 2007， 1140（12）： 189-194

13ZOU Long， LIN Hong， JIANG Jie. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（7）： 983-987

鄒 龍， 林 洪， 江 浩. 分析化學， 2007， 35（7）： 983-987

14Makoto M， Hitoshi I， Akiko S，Taeko N， Mari K， Masatafe T， Yukio S. J. Health Sci.， 2000， 46（4）： 304-309

15Sun X H， Tang J M， Wang J， Barbara A R， Lai K Q， Huang Y Q. Food Chem.， 2015， 172： 802-807

16Magnea G K， Sigurjon A， Hordur G K， Kolbrun S. Food Chem.， 2014， 159： 420-427

17Shima H A， Catherine M， Maria L， Ronald M， Jennifer M A. Amino Acids， 2009， 36： 317-326

18EscrigDoménech A， SimóAlfonso E F， HerreroMartínez J M， RamisRamos G. J. Chromatogr. A， 2013， 1296： 140-156

AbstractA method was developed to determine the content of Nεcarboxymethyllysine （CML） in the muscle tissues of turbot by gas chromatographymass spectrometric method. Turbot was selected as the research object， homogenized muscle tissue samples of turbot defatted by chloroform/acetone were pretreated followed by reduction， acid hydrolysis， purifying and derivatization （esterification and acylation）. The ion of m/z 392 was selected as quantitative ion and the ions of m/z 392， 365， 333， 305 were selected as qualitative ions in selected ion monitoring mode. The range of the linear calibration curve of CML derivative peak area and concentration extended from 1 μg/L to 200 μg/L. The limit of detection was 1 mg/kg and the limit of quantification was 5 mg/kg. The average recoveries ranged from 100% to 104% at 10， 150 and 350 mg/kg spiked levels and the relative standard deviation （RSD） was within 5% （n=5）.

《有機物絡合萃取化學》（第二版）

戴猷元、秦煒、張瑾、單欣昌 編著

本書分原理和應用兩部分，重點介紹了絡合萃取的化學原理、過程特征、萃取體系、分離工藝及模型預測、應用實例及前景。在有機物絡合萃取機理分析和研究日趨深入的基礎上，本次對全書進行了系統(tǒng)地修訂，并重點對應用實例部分進行了必要的補充。

本書可作為高等院校化工、生物化工、環(huán)境、制藥等專業(yè)師生的教學參考書，也可供上述專業(yè)從事分離過程研究開發(fā)、設計和運行的工程技術人員參考。

書號： 9787122233899定價： 98.0元

出版時間： 2015年6月開本： 16化學工業(yè)出版社出版