劉欣 姜慶 戚威

(1.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心 山東濰坊 161061;2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心 山東臨沂 276000;3.濰坊市食品藥品檢驗檢測中心 山東濰坊 161061)

近年來,隨著人們物質(zhì)文化生活水平的不斷進步,人們對于食品、藥品的質(zhì)量和安全性問題也越來越重視。根據(jù)相關調(diào)查顯示,食源性疾病和藥源性疾病患者的比例正在逐年上升,嚴重影響了人類的身體健康及生命安全[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學的逐漸發(fā)展,其為食品和藥品微生物檢測工作提供了新的發(fā)展思路。筆者現(xiàn)就現(xiàn)代分子生物學技術在食品、藥品微生物檢測中的應用及進展進行相應的探討,旨在為微生物檢測及分型方法的發(fā)展提供依據(jù)。

1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(PCR)是指在體外對特定的DNA片段進行迅速擴增的一種技術,其機理為在機體外對目標DNA和引物進行變性、退火、延伸等3個步驟,以使目標DNA進行迅速的特異性擴增。目前,人們通常采用PCR技術聯(lián)合核酸測序技術對微生物的基因型進行確定。隨著PCR技術的逐漸發(fā)展,其目前已發(fā)展多種相關的技術,且在微生物檢測中得到了廣泛的應用,具體包括:(1)多重PCR技術:該技術又稱為多重引物PCR技術,與常規(guī)PCR技術相比,其在PCR技術的翻譯體系中加入了多對特異性的引物。該技術除了能夠同時對多種致病菌進行檢測外,還可以準確的分類致病菌的亞型,并且還能夠夠?qū)ξ⑸锏闹虏⌒赃M行有效的判斷。(2)免疫捕獲PCR(IMPCR):該技術是通過將PCR技術與抗原抗體反應結合在一起,用于對微量抗原進行檢測的新技術。IM-PCR既保留了PCR技術的高度靈敏性,又使用了抗原抗體反應的特異性,具有操作簡單、檢測迅速、成本低及高度特異性等特點,研究表明其檢測的靈敏度可以達到普通PCR技術的100倍,但是該方法尚未成熟,使用還受到了一定的限制[2]。(3)熒光定量PCR:由于受到模板、引物及酶等因素的限制,常規(guī)PCR技術無法根據(jù)其擴增終產(chǎn)物對起始模板的拷貝數(shù)進行計算,即不能定量分析初始模板。而熒光定量PCR(RT-PCR)是通過在普通PCR技術的基礎上加入熒光基團,通過積累熒光信號來實時監(jiān)測PCR的整個過程,進而對初始模板進行定量分析。

2 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術的機理為按照DNA在不同濃度變性劑中接連程度的不同而體現(xiàn)出各不相同的電泳遷移率,從而對大小相同但堿基組成不同的片段進行分離。該技術聯(lián)合DNA測序技術常用于進行相似性聚類分析,在對食品和藥品的菌落組成、菌落動態(tài)變化及對食源性致病菌的檢查中得到了較為廣泛的應用。相關學者通過對DGGE、PCR及核算測序技術系統(tǒng)進行構建和優(yōu)化,有效分析了中藥川芎中真菌的群落結構,并通過聯(lián)合DNA測序技術,對不同產(chǎn)區(qū)中中藥川芎中真菌的差異性進行了想要的探究,從而得出了中藥川芎中真菌種群的種群結構和多樣性具有的固定性等是影響中藥川芎地道性產(chǎn)生的關鍵因素[3]。DGGE在對微生物種群的多樣性及動態(tài)等方面具有一定的優(yōu)勢,但是其不能檢測微生物的數(shù)量和代謝活性。

3 基因芯片技術

基因芯片技術的機理是通過和固定標記的、已知序列的核酸探針雜交后在進行核苷酸測序的方法,該技術目前在臨床診斷、新基因?qū)ふ摇⑺幬锏暮Y選及微生物檢測等領域得到了廣泛的應用,其具有高度的多樣性、自動化、并行性及微型化,能夠在同一芯片上同時對多種維生素進行迅速檢測。相關學者在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過程中分別采用宏觀基因組學、熒光定量PCR及基因芯片等3中技術對微生物的多樣性及功能進行檢測,結果顯示基因芯片具有搞高通量和集約化的優(yōu)點,并且通常聯(lián)合宏轉錄組技術可以有效分析微生物的群落和功能[4]。

4 隨機引物擴增多態(tài)性技術

隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)技術的機理為使用8～12個核苷酸長度的隨機引物于低溫環(huán)境下退火,經(jīng)過基因組DNA和引物之間的非特異位點錯配進行復性,同時利用PCR技術進行擴增。目前,RAPD技術在真菌、支原體和細菌等微生物的分型中得到了非常廣泛的應用。相關學者通過利用PAPD技術對淡水中分離出來的溶血弧菌和溶藻弧菌進行了有效的分型[5]。PAPD聯(lián)合其他技術能夠加快對重要基因的獲取速度,結合染色體步移技術可以對迅速完成對相關基因克隆分離及定位,而隨著該技術的成熟,其能夠在微生物的鑒定和分型上發(fā)揮更重要的作用。

5 結語

食品與藥品中存在的病原微生物直接關系到食品、藥品的質(zhì)量和安全,因此尋求新的、準確的、靈敏度高的微生物快速檢測技術對于確保食品和藥品的質(zhì)量安全具有非常重要的意義?，F(xiàn)代分子生物學技術的逐漸發(fā)展為食品、藥品微生物檢測工作提供了新的發(fā)展思路,明顯提高了微生物鑒定及分型的效率、準確性及靈敏度,并且還能夠?qū)ξ⑸镞M行有效的定性和定量。但是傳統(tǒng)方法依然在微生物的檢測和鑒定中依然具有無法替代的作用[6]。由此可見,在食品、藥品微生物檢測工作中聯(lián)合傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代分子生物學技術能夠得到更為準確和客觀的檢測結果,以有效支持相關部門對食品和藥品的質(zhì)量控制,確保人們的身體健康。

[1]劉銳萍,王峰,劉珊珊等.食品、藥品微生物檢測實驗室質(zhì)量控制方法分析[J].中國微生態(tài)學雜志,2013,25(7):847-850.

[2]胡路.食品衛(wèi)生微生物檢測用培養(yǎng)基質(zhì)量控制探討[J].中國科技縱橫,2014,15(14):258-258,260.

[3]張靜華.藥物微生物檢測實驗室質(zhì)量控制方法研究[J].醫(yī)藥前沿,2014,42(14):148-149.

[4]歐陽麗影,楊錚,楊利紅等.黑龍江省保健食品微生物檢測結果分析[J].中國保健營養(yǎng)(下旬刊),2014,37(5):2968-2969.

[5]紀亮.“2012中國食品微生物檢測技術及實驗室管理交流會”在蘇州舉辦[J].中國計量,2012,19(6):37-37.

[6]張詠梅.微生物檢測技術的發(fā)展現(xiàn)狀[J].山東商業(yè)職業(yè)技術學院學報,2013,13(6):封2-封3.