史艷芬，牛 云，羅 杰，笪冀平

（中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029）

地砷病在全球發(fā)展較快，嚴重威脅人類健康，預防是這類疾病最關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，目前還未找到能有效防止血管損傷的藥物。本作者前期研究結(jié)果表明NaAsO2誘導HUVECs細胞凋亡，HUVECs細胞凋亡是導致血管損傷的基礎(chǔ)，氧化應激可能是其發(fā)生的重要原因[1]。

人參皂苷 Rb1（Ginsenoside，Rb1）作為人參的主要成分之一，其內(nèi)含有能夠清除自由基的抗氧化物質(zhì)，發(fā)揮很多重要作用，其中包括：對很多種腫瘤細胞有一定的抑制作用；在抗衰老方面的功效，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以抗神經(jīng)細胞凋亡還可以促進血管再生[2]。所以人參皂苷Rb1對地砷病的預防和治療存在潛在價值。據(jù)報道人參皂苷Rg1對血管緊張素Ⅱ誘導的內(nèi)皮細胞凋亡具有一定的保護作用[3]；在研究人參皂苷抑制腦細胞凋亡作用時發(fā)現(xiàn)主要是通過減少NO產(chǎn)生，增加SOD活性[4]。此外，人參皂苷抗神經(jīng)細胞凋亡作用機制可能與線粒體內(nèi)的膜電位降低有關(guān)[5]。本研究在前期工作中已經(jīng)證實，NaAsO2誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡在地砷病血管損傷中的重要作用，而人參皂苷Rb1保護血管損傷的研究未見相關(guān)報道。

維生素B12（Vitamin B12）是一種含鈷的微量元素，在人和動物體內(nèi)必不可少。當人體缺乏該維生素時可導致血液異常，認知紊亂，及神經(jīng)病等，嚴重者可導致死亡。VB12來源于動物性食物，它的缺乏與飲食，吸收和代謝改變有關(guān)。有報道，維生素B12和葉酸共同作用于冠心病防治研究[6～8]。關(guān)于維生素B12對砷誘導內(nèi)皮細胞凋亡方面的研究未見報道。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）系來源于ATCC細胞庫。Rhodamine123和活性氧檢測試劑盒購于碧云天，IMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司，人參皂苷Rb1由吉林大學白求恩醫(yī)學院化學系贈送，維生素B12（Vitamin B12）購于鼎國公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

取出保存在液氮中的HUVECs細胞，立即在水浴鍋中快速搖動至凍存液融化50%以上時，轉(zhuǎn)入超凈工作臺操作。用移液器將凍存管內(nèi)含細胞的凍存液移入離心管，加入IMEM 5ml混勻，1000 rpm，離心5min，棄上清。加含10%胎牛血清IMEM培養(yǎng)液懸浮細胞沉淀，輕吹混勻，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加5ml含10%胎牛血清培養(yǎng)液放置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 亞砷酸鈉溶液的制備

亞砷酸鈉（NaAsO2）是一種白色粉末，易溶于水，分子量為129.91。用電子天平稱量NaAsO2粉末0.6495g，溶于裝有10ml IMDM（含10%胎牛血清）的小青瓶中，振蕩混勻，使NaAsO2充分溶解，得到NaAsO2溶液濃度為0.5mol/L，用不加血清的IMDM培養(yǎng)基稀釋成NaAsO2濃度為20μM的工作液。

1.4 實驗分組

常規(guī)培養(yǎng)的HUVECs細胞經(jīng)酶消化后以5.0×105/ml的細胞密度接種于6cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2條件下生長，當細胞長至指數(shù)增長期時，加入已經(jīng)用IMEM培養(yǎng)基配制好的不同濃度藥物溶液并進行分組：

①NaAsO2誘導組：加入上述NaAsO2儲存液使其終濃度為20μM。

②人參皂苷Rb1組（儲存濃度為4mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分別配制成 1.25μg/ml組、2.5μg/ml組、5μg/ml組。 Vitamin B12組（儲存濃度為50mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分別配制成5μg/ml組、10μg/ml組、20μg/ml組、40μg/ml組。人參皂苷Rb1與Vitamin B12共同作用組：1.25μg/ml人參皂苷 Rb1+10μg/ml Vitamin B12組 （混合 1）；2.5μg/ml人參皂苷 Rb1+20μg/ml Vitamin B12組（混合 2）；5μg/ml人參皂苷 Rb1+40μg/ml Vitamin B12組（混合 3）。

③對照組：加入等體積IMEM培養(yǎng)基。以上細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)24h，接著用這些制備好的細胞檢測凋亡和活性氧 （reactive oxidative species，ROS）水平。

1.5 Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡

收集各組細胞分別放于1.5ml的EP管中，1500rpm離心5min；去掉上清液，用0.1M的冷PBS緩沖液（4℃預冷）沖洗 3次；加入 500μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5μl Annexin VFITC，混勻；4℃、避光、孵育 15min；再加入 10μl PI， 混勻；4℃、避光、孵育 5min；用流式細胞儀檢測。

1.6 DCFH-DA活性氧檢測

收集各組細胞分別放于1.5ml的EP管中，1500rpm離心5min；去掉上清液，用0.1M的PBS緩沖液沖洗3次，在每個EP管中各加入500μl用無血清培養(yǎng)基稀釋得到濃度為10μM的DCFH-DA，充分混勻；避光、37℃細胞培養(yǎng)箱、孵育20 min；每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸；孵育完畢后，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFHDA；把準備好的細胞通過流式細胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0版軟件包進行統(tǒng)計學處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1保護NaAsO2誘導的HUVECs凋亡

圖1人參皂苷Rb1對HUVECs損傷的保護作用

圖2 維生素B12對HUVECs損傷的保護作用

作者在前期研究中已證實，NaAsO2誘導HUVECs凋亡，為了研究人參皂苷Rb1是否保護HUVECs凋亡，本實驗在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度人參皂苷Rb1，結(jié)果如圖1所示：人參皂苷組細胞凋亡率明顯低于NaAsO2作用組 （P＜0.05），且凋亡細胞率隨著人參皂苷濃度的增加而降低，表明人參皂苷Rb1可以降低NaAsO2誘導的HUVECs凋亡，從而發(fā)揮保護作用。

2.2 維生素B12保護NaAsO2誘導的HUVECs凋亡

為了研究維生素B12是否會保護HUVECs，本實驗在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度維生素B12，結(jié)果如圖 2所示：10μg/ml以下濃度組與NaAsO2作用組相比無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），10μg/ml濃度以上的維生素 B12組（包含 10μg/ml）細胞凋亡率低于NaAsO2作用組，并有統(tǒng)計學意義，且凋亡細胞率隨著維生素B12濃度的增加而降低，表明維生素B12≥10μg/ml可以降低NaAsO2誘導的HUVECs凋亡，從而發(fā)揮保護作用。

2.3 人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合作用保護NaAsO2誘導 HUVECs凋亡

人參皂苷Rb1能保護NaAsO2誘導HUVECs損傷，維生素B12同樣能保護NaAsO2誘導HUVECs損傷，如果兩者共用是否會有協(xié)同作用，本實驗在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度二者混合物，結(jié)果如圖3所示：二者混合物組細胞凋亡率顯著低于NaAsO2作用組（P＜0.01），且凋亡細胞率隨著混合物濃度的增加而降低，表明二者混合物可以明顯降低NaAsO2誘導的HUVECs凋亡，且二者具有一定的相加作用。

圖3 二者混合物對HUVECs損傷的保護作用

圖4 人參皂苷Rb1對NaAsO2改變HUVECs ROS生成的影響

圖5 維生素B12對NaAsO2誘導HUVECs ROS生成的影響

圖6人參皂苷Rb1和維生素B12共用對NaAsO2誘導HUVECs ROS生成的影響

2.4 人參皂苷Rb1對NaAsO2誘導 HUVECs內(nèi)ROS生成的影響

人參皂苷組孵育細胞后，用流式細胞儀檢測HUVECs細胞內(nèi)ROS含量。如圖4可見：在NaAsO2溶液中加入不同濃度的人參皂苷后，與NaAsO2組相比均能顯著降低細胞內(nèi)ROS含量，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），具有劑量效應關(guān)系。這一結(jié)果提示人參皂苷Rb1具有抗氧化應激活性。

2.5 維生素B12對NaAsO2誘導 HUVECs內(nèi)ROS生成的影響

維生素B12組孵育24h后，用流式細胞儀檢測HUVECs內(nèi)ROS含量。如圖5可見：10μg/ml以下濃度組與NaAsO2作用組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），10μg/ml濃度以上的維生素 B12組 （包含 10μg/ml）與 NaAsO2組相比，均能降低細胞內(nèi)ROS的含量，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而且具有劑量效應關(guān)系。這一結(jié)果說明維生素B12能降低ROS的產(chǎn)生，提示具有抗氧化應激活性。

2.6 人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合作用對NaAsO2誘導HUVECs產(chǎn)生ROS水平的影響

人參皂苷Rb1降低NaAsO2誘導HUVECs內(nèi)ROS的水平，維生素B12同樣降低HUVECs損傷后細胞內(nèi)ROS的水平，為探討二者聯(lián)合對細胞內(nèi)ROS的影響，本實驗在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度的二者混合物（具體見分組），結(jié)果如圖6所示：二者混合物組細胞內(nèi)ROS含量顯著低于NaAsO2作用組（P＜0.01），且 ROS 隨著混合物濃度的增加而顯著降低，具有劑量效應關(guān)系。表明二者混合物可以顯著降低NaAsO2誘導的HUVECs細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)二者不具有相加作用（P＞0.05）。

3 討論

地砷病患者長期處于高砷環(huán)境中，根據(jù)大量流行病學調(diào)查結(jié)果，這類患者早期主要表現(xiàn)為周圍血管疾病、皮膚損傷、動脈粥樣硬化、高血壓等以血管內(nèi)皮細胞損傷和凋亡為基礎(chǔ)的一類疾病。其原因可能是高濃度砷觸發(fā)了內(nèi)皮細胞的氧化應激通路和信號轉(zhuǎn)導途徑，更早地啟動了內(nèi)皮細胞的凋亡程序，導致血管內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂和損傷，從而阻礙細胞的正常增殖。

線粒體產(chǎn)生活性氧自由基 （ROS），ROS再作用線粒體，造成線粒體膜脂質(zhì)過氧化反應，破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)及功能損傷，從而導致細胞凋亡。在前期研究中我們已經(jīng)證明NaAsO2誘導HUVECs細胞凋亡主要通過線粒體途徑[1]。

本實驗采用體外培養(yǎng)HUVECs細胞，建立由高砷誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷模型，同時分別加入不同濃度的人參皂苷Rb1及維生素B12進行干預。研究結(jié)果顯示，20μM亞砷酸鈉導致內(nèi)皮細胞凋亡率遠大于正常對照組，且同時內(nèi)皮細胞釋放的ROS含量明顯增加，提示高濃度砷激活氧化產(chǎn)物，從而明顯加劇血管內(nèi)皮細胞氧化損傷。而在高濃度砷作用組中分別加入不同濃度人參皂苷Rb1、維生素B12及二者混合液，能顯著降低受損細胞的ROS含量，并減少高濃度砷導致的血管內(nèi)皮細胞凋亡。證實了人參皂苷Rb1及維生素B12分別對HUVECs細胞有一定保護作用，且二者混合作用更佳。

人參皂苷Rb1作為中藥人參中主要成分之一，具有提高機體免疫力、抗衰老、抗癌、抗輻射、抗缺氧多方面的功效成為近年來研究的熱點。在抗癌方面，相關(guān)研究在肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌等發(fā)現(xiàn)其作用機制主要表現(xiàn)在：人參皂苷誘導腫瘤細胞凋亡[9～11]；使腫瘤細胞周期停滯[12]。而在非腫瘤方面的研究顯示，人參皂苷Rb1的作用主要參與了體內(nèi)的氧化應激通路，如人參皂苷可抑制多巴胺誘導PC12細胞內(nèi)NO的生成，從而降低該細胞內(nèi) ROS含量來保護 PC12細胞的[13，14]；人參皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤細胞抗氧化應激的作用[15]。在波動性高糖導致HUVEC細胞凋亡過程中，人參總皂苷通過增強SOD活性保護HUVEC細胞的損傷[16]。本實驗選取人參總皂苷Rb1為干預藥物，結(jié)果亦證實了其有效清除細胞內(nèi)過多的自由基，阻止自由基和脂質(zhì)過氧化物過度產(chǎn)生的功效。提示其可能通過促使某些細胞凋亡抑制基因高表達而達到抑制細胞凋亡的作用，從而能在高濃度砷中增強血管內(nèi)皮細胞抗氧化和抗凋亡的能力，對細胞膜和線粒體膜起到保護作用。

維生素B12的研究主要集中在冠心病方面，最近有文獻報道在大鼠實驗中，維生素B12和葉酸能保護砷誘導的肝細胞損傷[17]，Majumdar等[18]也證實維生素B12和葉酸合用能保護砷誘導的線粒體和DNA損傷。本實驗結(jié)果同樣證實，維生素B12在高濃度砷環(huán)境中有效保護NaAsO2誘導的HUVECs凋亡，此結(jié)果主要是通過抑制細胞內(nèi)ROS水平實現(xiàn)；人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合使用后顯著降低了HUVEVs細胞的凋亡，有效保護了亞砷酸鈉對內(nèi)皮細胞的損傷。由于大量產(chǎn)生的自由基所引起的氧化損傷和內(nèi)皮細胞凋亡，是引起地砷病早期血管病變的重要因素，因此，清除體內(nèi)自由基是預防地砷病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵。本實驗為探索人參皂苷Rbl及維生素B12在延緩地砷病血管疾病方面的良好應用前景提供了理論基礎(chǔ)。但由于目前對高濃度砷產(chǎn)生氧化應激的通路及細胞凋亡機制尚不明確，因此有待更深入的研究予以證實。

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