刁曉艷 ，何 燕 ，周 黔

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科；2.貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室；3.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床檢驗室，貴陽 550004）

遺傳和環(huán)境因素的交互作用是原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH） 的主要發(fā)病機(jī)制，高血壓的基因研究雖報道很多，但仍無定論明確的高血壓相關(guān)的基因。高血壓的發(fā)病與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有關(guān)，作為候選基因之一的醛固酮合成酶（CYP11B2）基因是醛固酮合成的標(biāo)志基因。國內(nèi)外對CYP11B2基因-344T／C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系結(jié)論不一[1～5]。本研究探討了貴州漢族正常人群與高血壓人群CYP11B2基因（-344T/C）的特點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

EH組：2011年5月～2012年12月在我科門診就診的高血壓的患者，血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)按2010年中國高血壓指南的標(biāo)準(zhǔn)；排除繼發(fā)性高血壓、瓣膜疾病、心肌病及肝、腎衰竭等，共182例，其中男92 例、女 90例；平均年齡 57.58±10.94 歲。（2）對照組：選擇我科門診的健康體檢者182例，無高血壓家族史，其中男87例、女95例；平均年齡56.48±11.57歲。2組在性別與年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2組均為貴州籍漢族人，且互相均無血緣關(guān)系。

1.2 方法

（1）血壓測定：用標(biāo)準(zhǔn)水銀柱血壓計測量安靜休息坐位血壓；（2）生化指標(biāo)測定：清晨空腹抽取靜脈血檢測血脂（包括甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、載脂蛋白A1、載脂蛋白B100、脂蛋白 a）、血糖和尿酸；（3）采用國際標(biāo)準(zhǔn)化方法測量身高、體重。體重指數(shù)（BMI）=體重/身高2（kg/m2）；（4）基因的檢測。

①按經(jīng)典常規(guī)法 （酚-氯仿法）抽提白細(xì)胞DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后標(biāo)化為80～100ng/μl，-20℃?zhèn)溆谩?②PCR 擴(kuò)增上游引物序列為 5′-CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC-3′，下游引物序列為5′-CCT CCA CCC TGT TCA GCC C-3′。 25μl PCR 反應(yīng)體系組成為：10×PCR 緩沖液 2.5μl，25mmol/L MgCl21.8μl，4×dNTP （每種2.5mmol/L）2.0μl，10mol/L 引 物 各 0.6μl，DNA 聚合酶1.5U，模板DNA 80～100ng。PCR循環(huán)條件：94℃變性 40s，60℃退火 40s，72℃延伸 40s， 循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，有目的條帶者進(jìn)行限制性酶切分析。10μl酶切反應(yīng)體系組成為：PCR 產(chǎn)物 5.0μl，10×緩沖液1.0μl，HaeⅢ 5U， 加水補(bǔ)足體積后 37℃溫浴 4h。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測，判斷相應(yīng)基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS17.0軟件，采用t檢驗和單因素方差分析。各組的基因型和等位基因頻率用直接計數(shù)法，Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗基因型分布用χ2檢驗的方法，組間基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗或確切概率法檢驗。用逐步Logistic回歸分析不同基因型獲得性因素的差別。

2 結(jié)果

2.1 EH組及對照組CYP11B2（-344T/C）多態(tài)性分析

圖 1 CYP11B2（-344T/C）多態(tài)性的PCR產(chǎn)物和基因型電泳圖

研究對象DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增為538bp片段。如果CYP11B2基因無-344T→C點突變，該處將不存在 HaeⅢ酶切位點，故-344T基因型酶切產(chǎn)物為274bp+138bp+126bp 3個片段 （后兩者在瓊脂糖凝膠電泳圖上合為一條條帶，下同）；若有CYP11B2-344T→C點突變，則該處有HaeⅢ酶切位點，故-344C基因型酶切產(chǎn)物為203bp+138bp+126bp+71bp 4個片段（后者太小不易觀察）。因此電泳后TT基因型電泳條帶為274bp，CC基因型電泳條帶為203bp，TC基因型電泳條帶為274+203bp，各型均同時有138/126bp的小帶出現(xiàn)（圖1）。隨機(jī)抽取約10%的樣本進(jìn)行重復(fù)測量，一致率為100%。

2.2 EH組及對照組CYP11B2基因（-344T/C）位點基因型分布的H-W平衡檢測

實驗結(jié)果顯示，EH組和對照組人群CYP11B2基因（-344）位點均檢測出有 TT、TC 和CC等3種基因型，2組的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 EH組與對照組等位基因頻率和基因型的分布特點

表1示，2組間基因型分布有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），2組間等位基因頻率分布有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。而各組中不同性別無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

2.4 高血壓患者不同基因型獲得性因素的比較

把體重、尿酸、血糖、膽固醇、甘油三酯及BMI等指標(biāo)放在一起，用Logistic回歸分析結(jié)果顯示CT雜合子和CC純合突變基因型與野生TT基因型比較，差異均無意義（P＞0.05）。

表1 醛固酮合成酶基因CYP11B2（-344T/C）基因型頻率與等位基因頻率分布 n(%)

表2 高血壓組與對照組的獲得性因素比較

2.5 原發(fā)性高血壓組與對照組獲得性因素的比較

表2示，高血壓組的尿酸、血糖、甘油三酯、體重指數(shù)明顯高于對照組，且兩者之間的差異主要由女性引起（P＜0.05）。

3 討論

醛固酮合成酶（CYP11B2）基因為高血壓的候選基因之一，該基因的-344C/T基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系尚無定論，與獲得性因素之間的關(guān)系目前報道較少。

本研究對貴州漢族原發(fā)性高血壓人群進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，高血壓組和對照組之間CYP11B2基因-344 T/C基因型構(gòu)成比和等位基因頻率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），這提示，CYP11B2基因（-344 T/C）基因多態(tài)性可能和貴州原發(fā)性高血壓的發(fā)病有密切相關(guān)性，這與日本和國外部分研究一致[5]，與國內(nèi)部分相關(guān)研究一致[6～8]。

眾所周知，獲得性因素在高血壓的發(fā)病中起著重要的作用，由于生理的特殊性，女性高血壓與男性有不同的特點。生理劑量的雌激素具有擴(kuò)血管作用、維持正常血脂及胰島素敏感作用，還具有抗氧化的作用，而氧化應(yīng)激和血脂紊亂及肥胖有明顯的關(guān)系。女性高血壓發(fā)病在絕經(jīng)后明顯高于男性，與女性內(nèi)分泌變化相關(guān)，部分婦女雌、孕激素調(diào)節(jié)不穩(wěn)定可導(dǎo)致腎素分泌調(diào)控機(jī)制不正常而導(dǎo)致高血壓[9]。更年期女性患者體內(nèi)較低的雌激素水平、較高的孕激素水平以及性激素比例失衡，在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中起著促進(jìn)作用[10]。本研究提示，貴州漢族高血壓患者CYP11B2基因（-344 T/C）多態(tài)性沒有顯著影響獲得性因素的變化，而女性高血壓患者明顯受獲得性因素影響。這可能提示我們在日常生活中，特別是絕經(jīng)后女性，在失去雌激素的保護(hù)后，控制體重，低嘌呤、低脂、低糖飲食對預(yù)防高血壓的發(fā)生具有重要的意義。

通過本研究提供了貴州漢族CYP11B2基因-344 T/C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)病的相關(guān)依據(jù)，同時也表明了獲得性因素對高血壓的影響，更進(jìn)一步顯示了高血壓發(fā)病的多重機(jī)制[11]

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